尼可地尔后处理对急性缺血诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨尼可地尔后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制.方法 SD大鼠随机分为6组:假手术组、缺血再灌注组、缺血后处理组、尼可地尔后处理2、5和10 mg/kg剂量组.采用左冠状动脉前降支结扎30 min、再灌注120 min建立大鼠心肌缺血再灌注模型.缺血后处理组在缺血后再灌注前实施5次10 s再灌注-10 s再阻断循环.尼可地尔后处理组在缺血后再灌注前分别给予三个剂量10 min.检测血清肌酸激酶和丙二醛含量,及超氧化物歧化酶活性;检测心肌细胞的凋亡率和Caspase-3蛋白的表达.结果 尼可地尔后处理能使肌酸激酶、丙二醛含量降低,超氧化物歧化酶活性增高,心肌细胞凋亡率降低, Caspase-3蛋白表达减少.结论 尼可地尔后处理对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用,其机制可能与提高超氧化物歧化酶活性,增强心肌抗氧化能力,减轻氧自由基损伤,稳定细胞膜,抑制细胞凋亡有关.     

口服去氧氟尿苷后检测肝癌组织中氟尿嘧啶的临床意义

目的 探讨肝癌术前口服去氧氟尿苷后其代谢产物氟尿嘧啶在肿瘤及肝组织的浓度分布。方法 肝癌切除术前口服去氧氟尿苷,用高效液相色谱法测定转移淋巴结、卫星灶癌组织、肿瘤中央癌组织、肿瘤周边癌组织、癌旁肝组织及血液中氟尿嘧啶的浓度,并用原位末端标记法检测细胞凋亡情况。结果 口服去氧氟尿苷后转移淋巴结的氟尿嘧啶浓度为11.8μg/g,卫星灶癌组织为12.2μg/g,肿瘤中央癌组织氟尿嘧啶浓度为6.2μg/g,周边癌组织氟尿嘧啶浓度为9.7μg/g,癌旁肝组织氟尿嘧啶浓度为5.7μg/g,血液中氟尿嘧啶为浓度1.1μg/ml,转移淋巴结和卫星灶癌组织的氟尿嘧啶浓度显著高于周边癌组织(P<0.05),周边癌组织的氟尿嘧啶浓度显著高于中央癌组织和癌旁肝组织(P<0.05),而外周血氟尿嘧啶浓度显著低于肝癌组织和肝组织(P<0.05)。术前口服去氧氟尿苷后肝癌细胞凋亡指数增高。结论 口服去氧氟尿苷后在转移淋巴结和卫星灶中产生较高的的氟尿嘧啶,而中央肝癌组织和肝组织产生的氟尿嘧啶少。去氧氟尿苷术前化疗能增加肝癌细胞凋亡,提示去氧氟尿苷更适合肝癌术前化疗,预防肝癌术后的复发和微小转移。     

大鼠急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞凋亡及Bax,Caspase-8的表达

目的:研究大鼠急性胰腺炎腺泡细胞凋亡情况,凋亡调控基因Bax与凋亡蛋白酶Caspase-8的表达及其同疾病严重程度的关系.方法:胆胰管逆行注入不同浓度去氧胆酸钠方法制备大鼠急性胰腺炎模型,设假手术(SO)组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组和急性坏死性胰腺炎(ANP)组.采用TUNEL技术检测胰腺腺泡细胞的凋亡,RT-PCR与免疫组化方法分别分析胰腺组织Bax,Caspase-8 mRNA及蛋白的表达,对胰腺组织进行病理学评分并测定血清淀粉酶及IL-6,TNF-α含量.结果:与SO组比较,AEP与ANP组胰腺组织显示不同程度的病理损害,血清淀粉酶(63 413±6118,1 532 134±17 654 nkat/L vs 15 736±483 nkat/L,P＜0.01)及TNF-α(1.86±0.13,2.97±0.14μg/L vs 0.95±0.08 μg/L,P＜0.01),IL-6 (47.10±7.05,170.10±7.59 ng/L vs 29.20±4.47 ng/L,P＜0.01)浓度显著升高,且ANP组显著高于AEP组(P＜0.05);AEP与ANP组腺泡细胞凋亡指数显著升高(22.09±3.71,6.50±1.58 vs 0.13±0.05,P＜0.01),但ANP组显著低于AEP组(P＜0.05).同时发现,AEP与ANP组胰腺组织Bax (mRNA:1.530±0.501,1.046±0.337;蛋白:453.7±30.5,339.4±26.7)和Caspase-8(mRNA:0.595±0.17,0.505±0.173;蛋白:3606±337,3134±231) mRNA及蛋白表达水平均显著高于SO组(Bax mRNA:0.613±0.244,Bax蛋白:245.2±30.0;Caspase-8mRNA:0.357±0.130,Caspase-8蛋白:2396±266)(P＜0.01),ANP组Bax mRNA及蛋白表达水平显著低于AEP组(1.046±0.337,339.4±26.7 vs 1.530±0.501,453.7±30.5,P＜0.05),ANP组Caspase-8 mRNA及蛋白表达水平低于AEP组,但差异不具有显著性意义.结论:急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞发生凋亡伴随凋亡调控基因Bax与凋亡蛋白酶Caspase-8表达增加,并同病情严重程度呈负相关关系.     

沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响

背景与目的：二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在卵巢上皮癌铂类耐药细胞中高表达。该研究旨在探讨DHFR基因沉默对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响,为卵巢癌铂类耐药的治疗奠定基础。方法：设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,构建携带有目的基因的慢病毒载体细胞即转染组(DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞)及阴性对照组细胞(pGCSIL-SKOV3细胞)。采用流式细胞仪检测3组细胞在不同的顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/mL)下不同时间段(24、48及72 h)的凋亡情况以及IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)的周期变化;采用高效液相色谱法检测不同顺铂质量浓度(2.5、5.0和7.5μg/mL)不同时间段(24和48 h)药物作用后3组细胞内的顺铂浓度。采用透射电镜观察IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)3种细胞的超微结构变化。结果：将退火后的双链寡核苷酸片段连接到pGCSIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定干扰效果。在给药24、48和72 h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3三组细胞的凋亡率随着顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/mL)的上升而升高, DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48和72 h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。3组细胞在IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)给药24和48 h后,转染组G0/G1期细胞比例较阴性及空白对照组明显增多,G2/M、S期则反之;而给药72 h后,3组细胞以G2/M及S期为主,转染组低于阴性及空白对照组。采用高效液相法检测细胞内顺铂质量浓度时,转染组在2.5和5.0μg/mL顺铂质量浓度给药24和48 h后,其细胞内顺铂浓度均明显高于对照组。转染组在7.5μg/mL顺铂质量浓度给药24 h后,其细胞内顺铂浓度均明显低于对照组细胞,在48 h后却又高于对照组,差异有统计学意义(P=0.034,P=0.014)。未给药时,转染组细胞的微丝明显多于对照组,线粒体亦改变明显。IC50(4.4μg/mL)给药24和48 h后3组细胞均未见微丝;而给药72 h后微丝明显增多,且排列紊乱。结论：成功构建携带DHFR基因的pGCSIL干扰慢病毒载体的卵巢癌细胞。通过对DHFR下调后耐药性能研究得知,DHFR的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物耐药性有一定的联系,卵巢癌细胞中下调DHFR基因可以考虑作为多药耐药的逆转机制。     

热休克蛋白90在硫化氢对抗化学性缺氧引起的心肌细胞损伤中的作用

目的 探讨热休克蛋白90在硫化氢保护H9C2心肌细胞对抗氯化钴诱导的损伤中的作用.方法应用不同浓度的氯化钴处理H9C2心肌细胞,建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型.硫氢化钠(硫化氢的供体)在氯化钴处理H9C2心肌细胞前30 min加入培养基中,作为预处理.应用细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;Hoechst 33258染色荧光显微镜照相术检测凋亡心肌细胞的形态学改变;免疫印迹法检测热休克蛋白90的表达.结果 在600～1000 μmol/L浓度范围内,氯化钴处理H9C2心肌细胞24 h,呈剂量依赖性地抑制细胞存活率.在应用不同浓度氯化钴处理H9C2心肌细胞前30 min,应用400 μmol/L硫氢化钠可分别显著地抑制600、800、1000μmol/L氯化钴对心肌细胞的损伤作用,使细胞存活率明显升高.400 μmol/L硫氢化钠可促进H9C2心肌细胞的HSP90表达,在硫氢化钠作用6～9 h时,HSP90表达最多,作用18 h时表达恢复到基础水平.2 μmol/L热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素自身对H9C2心肌细胞无损伤作用,但是能加重氯化钴对心肌细胞的损伤作用,并能明显地阻断硫化氢抑制氯化钴对心肌细胞的损伤作用,使H9C2心肌细胞存活率降低,凋亡细胞数量增多.结论 硫化氢能保护心肌细胞对抗氯化钴诱导的损伤作用,并能上调热休克蛋白90表述.热休克蛋白90介导硫化氢的心肌细胞保护作用.