变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定

目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因（gbpD）失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.     

人类遗传病的动物模型

应用基因打靶的方法，可以制造出人类遗传性疾病的动物模型，这种动物模型有利于单基因遗传病的研究。本文简述了遗传病动物模型的制作方法及其中的问题，指出了遗传背景对于动物模型的重要性。在不同的遗传背景下培育突变动物会发现一些有调节作用的基因，有利于改善动物模型。因为人与动物某些基因表达的不同，有些遗传病的症状不能在动物模型中复制。人类多基因遗传病的影响因素复杂，动物模型较难制作，但会对这类疾病的研究，尤     

α1,3GT siRNA打靶杂合子猪肝细胞阴性表达半乳糖转移酶

目的 研究联合应用基因敲除及RNA干扰(siRNA)技术对猪α1，3半乳糖转移酶(α1，3GT)基因修饰后，阳性猪杂合子( ／-)肝细胞的GT基因是否获得有效沉默并影响人天然抗体介导的细胞毒性作用。方法用pPNTloxPneo和PMXSV／U6载体构建猪GT基因敲除并siRNA载体，转染中国实验用小型猪的肝细胞，筛选获取杂合子克隆( ／-)。Northern blot检测GT mRNA表达，四甲基偶氮唑盐方法评估天然抗体细胞毒性。结果 野生型和pPNTloxPGT转染的杂合子猪肝细胞的inRNA表达阳性，而pPNTloxPGTsiRNA载体转染的杂合猪肝细胞阴性表达α1，3GT mRNA;pPNTloxPGT转染细胞( ／-)和野生型( ／ )猪肝细胞对人天然抗体介导的细胞毒性实验敏感，而pPNTloxPGTsiRNA转染细胞( ／-)则对毒性试验敏感性明显下降，只检测到17％细胞毒性。结论 对猪GT联合应用基因敲除及SiRNA能够在阳性猪杂合子肝细胞内有效沉默GT基因，降低猪肝细胞对人天然抗体细胞毒的敏感性。     

锌指蛋白ZBTB20生物学功能的研究进展

锌指蛋白ZBTB20是ZBTB锌指蛋白亚家族的新成员,与已知的BCL6和PLZF同源.通过基因打靶小鼠和疾病人群研究,学者们发现ZBTB20在肝脏、胰岛、神经系统和免疫系统等多个器官与系统中具有重要生理学功能,是个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢等正常生理过程所必需的调节分子.ZBTB20表达或功能异常可导致个体发育障碍,与智障、肿瘤和代谢性疾病等多种重大疾病的病理生理过程密切相关.作为甲胎蛋白基因的主要转录抑制因子,ZBTB20在出生后肝脏甲胎蛋白基因的表达失活中发挥了关键性作用,且与肝癌预后密切相关.人群中ZBTB20基因的缺失与多种肿瘤有关,其点突变可导致Primrose综合征.本文就ZBTB20的生物学功能研究进展作一综述.     

牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株的构建

目的构建牙龈卟啉单胞菌毒力岛基因PG0839突变菌株,为研究PG0839基因功能提供实验基础。方法扩增1 584 bp PG0839基因片段,对聚合酶链反应（PCR）产物和pUC19载体进行BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,连接酶切产物得到质粒pPG0839-1。将2 101 bp erm基因产物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRⅤ位点,构建质粒pPG0839-2,作为电穿孔的供体质粒。电穿孔转化于受体菌牙龈卟啉单胞菌W83菌株,红霉素抗性培养基筛选阳性克隆,命名为PG0839基因突变菌株。结果运用插入失活方法构建PG0839基因突变菌株,进而通过酶切、测序、PR和反转录PCR对PG0839基因突变菌株进行验证,证实PG0839基因突变菌株构建成功。结论本实验成功构建PG0839基因突变菌株。     

细胞重编程及其在再生医学中的应用前景 ——写在2012年诺贝尔生理学或医学奖颁布之际

2012年10月8日,英国发育生物学家约翰·格登爵士(John B.Gurdon)和日本生物医学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)因"发现成熟细胞可以被重编程(reprogrammed)为多能性(pluripotency)"而获奖,这次获奖是在短短五年时间内干细胞领域的第二次获奖,上一次获奖是在2007年,马丁·埃文斯因1981年成功分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)而与另外两名从事"基因打靶"(gene targeting)的科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯共享诺贝尔生理学或医学奖.     

基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用

基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础，利用该技术构建的模式生物（例如基因敲除小鼠）已经广泛地应用于人类基因的研究，截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系。同源重组介导的基因打靶技术（基因敲除或敲入）是判定基因功能的强有力工具。与基因敲除小鼠相比，人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少，但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的。基因打靶技术最常见的应用是通过使所有等位基因连续失活建立基因敲除细胞系；     

诱导性基因打靶的原理及有关应用

诱导性基因打靶是一种借助于 Cre/ lox P系统的作用、利用控制重组酶 Cre表达的启动子或 Cre酶活性的可诱导性、或重组酶 Cre定位表达的基因转移系统的宿主细胞特异性等特性 ,从而在一定的发育阶段和一定的组织细胞中对特定基因进行遗传修饰的基因打靶技术