hGM—CSF基因转导的人胃癌,肝癌细胞研究

ｈＧＭ－ＣＳＦ是一种细胞因子，能通过多种机制激活机体免疫功能。为了研究ｈＧＭ－ＣＳＦ修饰的人肝癌、胃癌细胞的免疫功能的变化，将含该基因的逆转录病毒载体ＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选较高滴度病毒分泌株（滴度为１．５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ），用病毒上清感染肝癌（ＨＨＣＬ）和胃癌（ＭＫＮ４５），筛选后测ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，最高分别为２７１Ｕ／１０６细胞·２４小时和２４３．８０Ｕ／１０６细胞·２４小时。ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在肝、胃癌细胞中整合，未发生重排。ＭＨＣ分子测定结果显示经修饰的肝癌ＨＨＣＬ细胞ＭＨＣ分子的表达无改变，而修饰后胃癌细胞ＭＫＮ４５的ＭＨＣⅠ类分子表达明显增加。本实验为今后瘤苗研制提供了资料。     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ，反式插入方向培养上清没有活性     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子逆转录病毒载体的构建

构建了ｈＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ逆转录病毒载体，将其分别转染甲胎蛋白表达阳性和阴性的肝癌细胞系Ｈｕ－Ｈ７和ＨＬＥ。结果，ｈＧＭ－ＣＳＦ在两种人肝癌细胞系中有表达。表达产物能分泌到肝癌细胞外，分泌到细胞的产物用ＴＦ－１细胞检测证明具有生物学活性。