血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。     

抑制脑血栓形成的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸的亲和性研究

目的为抑制脑血栓形成,合成与TF基因启动子区切应力反应元件(SSRE)形成三链DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸(TFO)。方法设计TFO序列14条,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。硫代磷酸酯修饰在TFO的3'末端进行。应用电泳迁移分析(EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。结果在设计合成的14条寡核苷酸中,与靶序列能形成三链DNA的TFO只有T21GTa、T14GTa和T15GTa,其Kd值分别为3.6×10-10、1.0×10-9和1.0×10-8(M),经硫代磷酸酯修饰后分别为:2.3×10-9、3.8×10-9和1.5×10-8。结论硫代磷酸酯修饰的T21GTa-ps、T14GTa-ps和T15GTa-ps能够与TF基因启动子SSRE的3个位点形成三链DNA。     

Antisense Smad2 inhibits high glucose-stimulated production of extracellular matrix in cultured rat glomerular mesangial cells

Transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)is amultifunctionalpolypeptidethatregulatesanum-berofcellularprocesses,includingcellprolifera-tion,differentiation,apoptosis,migration,matrix synthesis,andtheimmuneresponse[1,2].Inchron-icrenaldiseases,TGF-β1isakeymediatorofex-tracellularmatrix(ECM)accumulation[3].Oneof thetargetrenalcellsforTGF-β1isglomerular mesangialcellsthatarecapableofproducingcom-ponentsofECM,suchascollagens,lamininand fibronectin[4,5].Recentstudiesindicatedthatinhi-bitionofT…     

反义AKT2 RNA抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 研究反义AKT2RNA对U251人脑胶质瘤细胞在体内外的生长抑制效用。方法 将逆转录病毒pLXSN为载体的反义AKT2构建体转染U251人脑胶质瘤细胞系，应用蛋白印记确定基因转染前后AKT2的表达水平。流式细胞法与Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的增殖活性。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导pLXSN、pLXSN-AS-AKT2基因治疗对U251细胞生长抑制作用。在28d的观察期内定期测量皮下肿瘤体积，对肿瘤标本应用免疫组化的方法进行AKT2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达比较。结果 脂质体介导pLXSN-AS-AKT2可显著抑制U251细胞AKT2表达。与对照组和pLXSN转染组比较，细胞周期分析结果表明AK—AKT2转染组进入S期的细胞数减少了8．5％～8．9％，而进入G0＋G1期细胞则增加了7．9％～8．6％。Matrigel基质生长实验显示对照组和pLXSN转染组细胞呈正常形态贴壁生长，而AS～AKT2转染组细胞不能贴壁生长，呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示pLXSN-AS-AKT2显著抑制皮下肿瘤生长，组织病理学分析显示AS-AKT2转染组AKT2表达下降而GFAP表达上调。结论 体内外实验证明反义AKT2方法在抗胶质瘤增殖方面作用重要，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的优选靶标。     

Microtubule-associated protein tau is required for axonal neurite elaboration by neuroblastoma cells.

NB2a/d1 neuroblastoma cells constitutively express multiple isoforms of the microtubule-associated protein tau and incorporate this protein into the axonal neurites elaborated during serum deprivation. To examine whether or not tau played an essential role in axonal outgrowth, cells cultured in serum-free medium were treated at 24 h intervals with antisense- and sense-oriented cDNA oligonucleotides (25 or 36 mers that span or are upstream of tau initiation codon) and were simultaneously serum deprived. Oligonucleotide uptake was confirmed by determination of intracellular levels of radiolabeled oligonucleotides. Treatment for 48 h with tau antisense oligonucleotides reversibly inhibited the expression of tau and the number of neurite-bearing cells compared with treatment with sense oligonucleotides. By contrast, tubulin expression was not affected. When cells were treated with antisense oligonucleotide simultaneously with serum deprivation, the initial outgrowth of neurites was unaffected, but continued neurite elongation was prevented. By contrast, neurite outgrowth at 4 h was inhibited when cells were pretreated with tau antisense 24 h before serum deprivation. Furthermore, intracellular delivery of anti-tau antiserum prevented neurite outgrowth and, in cells that had previously been deprived of serum for 24 h, induced retraction of existing neurites. These findings indicate that both the initiation and the continued outgrowth of neurites are dependent on tau and that pre-existing cytoplasmic pools of tau can mediate initial neuritogenesis.     

Improved Cellular Delivery of Antisense Oligonucleotides Using Transferrin Receptor Antibody-Oligonucleotide Conjugates

This work is dedicated to the memory of the late Dr Ian Walker.     

EphB4反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的作用

目的观察EphB4反义寡核苷酸(ASODN)对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响,探讨EphB4的生物学功能。方法人工合成EphB4 ASODN,脂质体转染U87细胞。分别应用RT-PCR以及免疫组织化学染色方法检测EphB4 mRNA和蛋白质,评估阻抑效应;并应用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡;采用Boyden侵袭小室法检测细胞迁移和侵袭力。结果(1)由脂质体转染的EphB4 ASODN对U87细胞EphB4 mRNA和蛋白质表达具有不同程度的抑制作用,且呈现一定的时间-剂量依赖性,600nmol/LASODN作用于U87细胞72h,EphB4 mRNA相对表达量为0.30±0.05,EphB4蛋白表达水平亦明显减弱。(2)各实验组EphB4 ASODN对U87细胞增殖均具有抑制作用,呈明显时间-剂量依赖性;以600nmol/LASODN作用72h,U87细胞生长抑制率达到68.70%,而对照组则无明显抑制作用。(3)EphB4 ASODN诱导U87细胞凋亡呈剂量依赖性。(4)EphB4 ASODN组U87细胞的跨膜数为17.82±2.35,与空白对照组及NSODN组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论EphB4在人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中发挥重要作用,可能成为脑胶质瘤基因治疗的一个新靶点。     

耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞c-myc的表达上调及与耐药的关系

目的观察耐药乳腺癌细胞c-myc表达及其反义寡核苷酸对耐药的逆转效应,探讨c-myc在耐药调控中的作用。方法运用流式细胞仪检测乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adr和其药敏亲本系MCF-7的c-myc表达水平。MTT法测定阿霉素作用于上述细胞的药物半数抑制浓度(IC50)。结果MCF-7/Adr耐药细胞c-myc的表达率为70.48%,其亲本药敏细胞系MCF-7c-myc表达率仅46.02%,前者显著高于后者(P<0.05)。阿霉素单独作用于MCF-7/Adr,IC50值为(22.00±1.92)μmol/L,但与4μmol/Lc-myc反义寡核苷酸共孵育后,阿霉素的IC50值则显著下降为(9.60±1.04)μmol/L。结论与其亲本药敏细胞相比较,MCF-7/Adr的c-myc表达显著上调,抑制c-myc的过表达可部分逆转MCF-7/Adr的阿霉素抵抗,提示c-myc参与肿瘤耐药的发生。     

人正、反义转化生长因子beta1基因真核表达载体的构建

目的 :构建人转化生长因子beta 1(TGFβ1)正、反义基因真核表达载体。方法 :从人胎脑的cDNA文库中扩增出TGFβ1共 12 84bp长的DNA片段后 ,与T载体直接进行高效连接 ,并测序证实无突变。接着利用TGFβ1引物两端所设计的酶切位点将目的片段定向亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )。构建的正反义表达重组体 (pcDNA3.1 TGFβ1和pcDNA3.1 antiTGFβ1)经限制性内切酶消化证实其中有目的片段完整插入。结果 :本实验成功构建了人正、反义TGFβ1基因真核表达载体。结论 :人正、反义TGFβ1基因真核表达载体的构建 ,为今后研究腹膜纤维化的防治奠定了实验基础。     

CpG ODN增强乙肝疫苗在老年小鼠中的免疫应答

目的：探讨CpG ODN对老年小鼠的体液和细胞免疫应答的增强作用。方法：选用老年C57BL／6小鼠，将乙肝疫苗和10μg、20μg CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内，两周后以同样剂量加强免疫一次，再过3周后摘除眼球取血，用EILSA方法检测抗HBs16；抗体和IL-12；无菌取脾脏作HE染色，观察脾脏淋巴细胞变化。结果：10μg和20μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍；产生的IL-12水平较对照组有明显升高，且20μg比10μCpG组产生的IL-12水平更高。光镜下各组的脾脏淋巴细胞的变化如下：正常老年鼠组脾脏淋巴细胞较正常青年鼠组明显稀少；老年鼠 10μgCpG组脾脏淋巴细胞较正常老年鼠组有了明显增加，且细胞核也明显增大；20μgCpG组增加的更加明显。结论：CpG ODN能增强乙肝疫苗在老年小鼠中的体液和细胞免疫应答。