不同无性系杜仲含胶细胞密度的动态研究

文章通过对不同无性系杜仲叶中含胶细胞密度的测量,对其生长动态作了分析研究,结论如下:不同无性系含胶细胞的密度在七月中旬达到最大;在同一引种地的雌雄株之间,雄株含胶细胞的密度不完全小于雌株。     

大鼠维生素D受体蛋白表达载体的构建及遗传性高钙尿性结石大鼠十二指肠维生素D受体cDNA序列分析

目的构建大鼠维生素D受体（VDR）蛋白表达载体，测定并分析遗传性高钙尿性结石（GHS）大鼠VDRcDNA序列。方法采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法扩增含VDR蛋白编码基因序列，将扩增产物克隆至真核表达载体pcDNA3．1／Zero（＋），对5只GHS大鼠和4只正常尿钙对照（NC）大鼠十二指肠VDRcDNA序列进行测序分析。结果琼脂糖凝胶电泳示PCR扩增产物碱基数目与目的片段大小一致。对重组质粒的分析表明，插入片段的序列与发表的VDR基因编码序列相同。5只GHS鼠和4只NC鼠肠VDR cDNA序列均有3个相同的位点不同于已公布的大鼠肠VDR cDNA序列：在256bp位点：C取代G；569bp位点：G代替A；1658位点：A替代G。另外，GHS鼠在1795bp位点发生改变，G取代A，而NC鼠则无改变。结论大鼠维生素D受体蛋白编码序列被成功地克隆至表达载pcDNA3．1／Zero（＋）上。GHS大鼠基因编码区的序列组成同NC大鼠相一致，但GHS鼠1795bp位点的碱基改变未见于NC鼠。     

B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清。方法：根据B组轮状病毒（GBRV）WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区。将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E.coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清。结果：经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白。制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1：500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号。结论：人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值。     

中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外生长特性的比较

目的 比较相同发育阶段中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外的生长特性。方法 胚胎小鼠(E14)于无菌条件下分别分离并收集皮层、纹状体、间脑、中．后脑和脊髓，各部分制备成单细胞悬液，接种在添加有纤维细胞生长因子(FGF)的无血清培养液内，神经干细胞克隆生成后，经免疫细胞化学方法鉴定细胞特性，并在相同条件下进行传代，相差显微镜下观察克隆生成和细胞的迁移特性。结果 在添加有纤维细胞生长因子的无血清培养液中，少量接种的单个细胞会增殖并形成悬浮于细胞培养液中的细胞克隆。这些克隆具有生成新克隆并分化成神经元和胶质细胞的能力。在相同发育阶段，皮层、纹状体、间脑均可生成悬浮的克隆，其中皮层生成的速度最快，纹状体、间脑较慢，中．后脑、脊髓生成克隆的速度最慢；生成克隆后，皮层克隆的贴壁能力最差，贴壁的克隆少有细胞从其底部迁出，纹状体、间脑克隆较易贴壁，贴壁克隆底部有明显的细胞迁出，中．后脑、脊髓生成的克隆不易悬浮，很快贴壁，在贴壁克隆的底部有大量的细胞迁出。结论 在无血清培养液中，神经干细胞可在体外增殖、传代并分化生成神经元和胶质细胞，不同部位来源的神经干细胞在体外生成克隆的速度和细胞迁移性不同，这可能同体内特定部位细胞的发育特性有关。     

军团菌MOMPS基因的克隆并在原核系统中表达

以军团菌DNA为模板，PCR扩增获得军团菌主要外膜蛋白基因（Major outer membrane protein gene，ompS），与原核表达质粒pUC18定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21，并用限制性酶酶切分析、聚合酶链式反应、核酸序列分析、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们扩增出了军团菌914bp的ompS基因，成功构建了重组质粒pLPompS，并在原核系统中得到了表达。     

酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建

利用PCR方法，从阴离子交换蛋白1（AE1）全长cDNA中扩增出约350bp c末端cDNA片段，测序后将其克隆至pGADT7载体上，用醋酸锂法构建好的pADT7-AE1-c末端转染酵母菌HA109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明，获得了530bp AE1c－末端cDNA,pGADT7-AE1-c末端对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。     

人白细胞介素18（hIL—18）的cDNA基因克隆及序列测定

目的：克隆人白细胞介素18（IL－18）全长cDNA基因,进一步探讨人白细胞介素18的功效。方法：采用RT－PCR的方法从人肝组织中扩增出人白细胞介素18（IL－18）基因,并克隆到真核表达的绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-NI中,结果：经PCR及DNA序列测定得以证实其序列与文献报导一致,结论：该实验成功地克隆了IL－18cDNA,并将其重组构建了含有IL－18cDNA的真核表达载体pEGFP-N1-IL18。     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的克隆并体外表达HPV58E6,为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础.方法通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白,化学发光法检测,X光胶片曝光显影鉴定.结果酶切电泳证实质粒构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带,X光胶片亦在相应位置出现印迹条带.结论成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,为其致癌作用和治疗的研究奠定基础.     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白cDNA分子克隆及其mRNA在肾小球上皮细胞的表达

Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎是一种用于人类膜性肾病的自身免疫病模型。ｇｐ３３０糖蛋白和４４ｋＤ受体相关蛋白（ＲＡＰ组成Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎抗原复合物（ＨＮＡＣ），被证明是ＨＮ的主要致病原。本研究中，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术，克隆了ＲＡＰ基因，用Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术克隆了ＲＡＰ羧基端１１８个氨基酸的基因，ＤＮＡ序列分析克隆基因与ＲＡＰ相同，原位杂交发现ＲＡＰｍＲＮＡ在肾小球上皮细胞表达。