反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

层黏连蛋白受体反义核酸对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究67 kD层黏连蛋白受体(67kDLN-R)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对卵巢癌细胞HRA体外侵袭转移能力的影响.方法:采用流式细胞仪、RT-PCR及Transwell小室的方法检测反义核酸对67 kD LN-R基因和蛋白表达影响,及转染前后细胞体外侵袭转移能力变化.结果:67 kD LN-R ASODN可从蛋白质和mRNA水平下调67kDLN-R的表达,且下调作用呈剂量依赖性.与正义组及对照组相比差异有显著性(P＜0.05).体外侵袭实验证实转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性.结论:67kDLN-R ASODN可降卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,有望为卵巢癌治疗提供新方向.     

转染bcl-2反义寡核苷酸诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的体外实验研究

目的 :体外研究bcl- 2反义寡核苷酸对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响 ,旨在寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法 :(1)免疫组化、半定量RT -PCR法鉴定ASODN的有效性。 (2 )Giemsa染色、流式细胞术凋亡指数 (AI)、DNALadder检测细胞凋亡。结果 :(1)转染后 ,免疫组化结果示Bcl- 2蛋白表达降低 ;半定量RT -PCR结果显示bcl- 2mRNA表达较对照组明显减弱 (P <0 0 5 )。 (2 )转染后 ,Giemsa染色可见凋亡小体 ;流式细胞术结果显示转染后AI为 :6 6 0± 0 70 % ,明显高于对照组 1 79± 0 19% (P <0 0 5 ) ;DNALadder呈现具有凋亡特征的梯带。结论 :(1)本实验所设计的ASODN能有效地抑制bcl- 2基因的表达。 (2 )转染ASODN (bcl-2 )能够显著增加Hela细胞凋亡。进而有望通过转染ASODN提高肿瘤细胞的放射敏感性。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制胆囊癌血管生成的研究

目的探讨Oligofectamine介导的血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growthfactor,VEGF)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)转染对人胆囊癌细胞GBC-SD裸鼠移植瘤的VEGF表达和血管形成的影响。方法裸鼠接种GBC-SD细胞建立移植瘤模型,随机分为A、B、C三组,各组裸鼠在接种1周后,分别给于200μl磷酸缓冲液(PBS)、VEGFSODN100μg Oligofectamine0.5μl及VEGF ASODN100μg Oligofectamine0.5μl,每3天1次,连续治疗5周,观察各组裸鼠的成瘤性、体积及瘤重的变化,各组移植瘤中VEGF表达及微血管密度(MVD)变化。结果三组裸鼠3周时的成瘤率,C组显著低于A、B两组(P<0.05),6周时各组的成瘤率无差异。各组移植瘤6周时的体积和瘤重相比C组显著低于A、B两组(P<0.05),C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。A、B两组移植瘤VEGF表达及MVD均无显著性差异(P>0.05),而C组移植瘤VEGF的表达较A、B两组明显减弱(P<0.05),MVD明显小于A、B两组(P<0.05)。结论VEGF ASODN在体内能显著抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的增殖,降低其在裸鼠体内的成瘤性,抑制VEGF在蛋白水平的表达,减少裸鼠移植瘤中血管的形成,降低微血管密度。     

VEGF反义寡核苷酸对舌鳞癌影响的实验研究

目的:研究血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸(VEGF-ASODN)对裸鼠荷人舌癌肿瘤的生长抑制作用。方法:20只BALB/C裸鼠分为4组,每组5只,实验1～3组建立人舌癌荷瘤裸鼠移植瘤模型,并注射相应试剂;第4组为未荷瘤对照组。①VEGF-ASODN组:于瘤体及瘤周注射VEGF-ASODN66μg。②错义寡核苷酸组:注射错义寡核苷酸66μg。③生理盐水组:注射生理盐水。各组每3天注射1次,共注射7次。实验结束后2d,处死动物,取血清测VEGF蛋白,测量肿瘤大小及重量,取肿瘤组织切片用免疫组织化学方法检测VEGF、PCNA、CD34的表达,计算微血管密度(microvesseldensity,MVD)和增殖细胞核抗原标记指数(PCNALabelindex,PLI),分子原位杂交测VEGFmRNA表达。结果:VEGF-ASODN组荷瘤裸鼠血清VEGF蛋白水平,肿瘤的体积和重量,VEGFmRNA及其蛋白和PCNA、CD34的表达均显著低于对照组。结论:VEGF-ASODN通过抑制VEGF表达,从而抑制舌癌细胞的生长、增殖。     

高精度原子力显微镜显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸连接

为了将高精度原子力显微镜(AFM)用于显示超顺磁性氧化铁标记的c-erbB2癌基因反义寡脱氧核苷酸探针(磁性反义探针)与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸的连接,我们在磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞基础上,用AFM对转染后的肿瘤细胞进行观察,并同时对转染后的肿瘤细胞进行蛋白表达检测及MRI成像,以进一步证实AFM的观察结果。从AFM显示的磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞后单个细胞的全貌图及局部放大图发现,探针中反义寡脱氧核苷酸中的脱氧胞嘧啶核苷酸闭环与肿瘤细胞mRNA嘌呤核苷酸环相连接;此外,磁性反义探针能特异性抑制SK-Br3细胞c-erbB2的蛋白表达,MRI显示磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞的信号强度最低(P<0.05)。实验表明,AFM可以清楚显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞核mRNA核苷酸的连接。     

PDGF-α受体反义寡核苷酸对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)对体外人视网膜色素上皮(humanretinal pigment epithelium,HRPE)细胞增殖和凋亡的作用。方法:使用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至细胞株HRPE细胞,MTT法检测对HRPE细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞;流式细胞仪检测HRPE细胞的周期和凋亡率。结果:PDGFR-αASODN转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)。结论:沉默PDGFR-α基因表达可显著抑制HRPE细胞的增殖,并能诱导其凋亡。     

靶向抑制存活素表达对卵巢癌细胞株生物学行为的影响和意义

目的：通过存活素（ Survivin）反义寡核苷酸（ ASODN）转染人卵巢癌SKOV3细胞株抑制存活素Survivin蛋白表达,分析靶向抑制 Survivin 表达对卵巢癌细胞生长、细胞周期改变、凋亡、侵袭迁移能力的影响和意义。方法用脂质体（LipofectamineTM2000）介导Survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,通过四唑盐比色法（MTT法）分析细胞生长活性改变,通过流式细胞仪检测Survivin蛋白表达改变、细胞周期分布和细胞凋亡率,通过Transwell小室检测细胞侵袭迁移能力的改变。结果转染Survivin ASODN后卵巢癌细胞株中Survivin蛋白表达明显下降（t＝7．82,P＜0．01）。细胞生长明显减慢（F＝3．75,P＜0．01）,600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为49．50±20．76％,接近IC50值。细胞凋亡明显增加（t＝6．37,P＜0．05）,细胞增殖明显下降（t＝-10．35,P＜0．01）,更多的细胞停留在G0/G1期（t＝10．38,P＜0．01）。细胞迁移和侵袭能力下降（t值分别为19．26、27．42,均P＜0．01）。结论 Survivin ASODN通过靶向抑制卵巢癌细胞存活素表达,可抑制细胞生长,促进细胞凋亡,减少进入有丝分裂的细胞数,降低细胞的侵袭迁移能力,从而达到治疗卵巢癌的作用。靶向抑制存活素的治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段。     

反义核酸与疾病治疗研究进展

反义寡核苷酸是根据碱基互补原理，用人工或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭目的基因的表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。反义寡核苷酸药物的发展开拓了基因药理学的一个新领域。本文综述了反义寡核苷酸的分类核作用机制及其在病毒感染、肿瘤和心血管等疾病治疗中的应用，并提出这一领域中存在的一些问题。     

Effects of antisense oligonucleotides targeting VEGF on radio sensitivity of uterine cervix cancer Hela cells

Objective： To determine the impact of antisense oligonucleotides targeting vascular endothelial growth factor （VEGF） on radiosensitivity of uterine cervix cancer Hela cells. Methods： VEGF antisense oligodeoxynucleotides （ASODN） was transfected into Hela cells by liposome-mediated method. Cells transfected with the oligodeoxynuclecotide and saline were used as control groups. Cells were irradiated by 6 MV X ray at the dose of 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy and 6 Gy respectively. The expression of VEGF mRNA was determined by RT-PCR. Apoptosis were evaluated using FCM. Cloning efficiency was determined by colony formation assay. Results： The expression of VEGF mRNAwas inhibited by ASODN （P 〈 0.01） in Hela cells. The inhibited activation which was influenced by radiation resulted in increasing apoptosis （P 〈 0.01） and inhibiting plating efficiency （P 〈 0.01）. Conclusion： The expression of VEGF induced by X irradiation in Hela cells can be blocked by VEGF ASODN. Treatment with VEGF might increase apoptosis in HeLa cells and enhance radiosensitivity.