中国脊髓灰质炎疫苗株病毒VP1区基因突变热点分析

目的研究中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测系统中分离到的脊髓灰质炎(脊灰)疫苗株病毒VP1区基因核苷酸突变热点及其分子生物学特征。方法对从中国1996~2002年AFP病例中分离的693株单血清型脊灰病毒进行VP1区核苷酸序列测定和分析,并对序列结果进行比对分析和统计学分析。结果VP1区核苷酸序列测定和分析结果,未检出脊灰野病毒,全部为脊灰疫苗株病毒。在所有疫苗株病毒中,发现了一些VP1区基因核苷酸突变热点,例如Ⅰ型病毒的nt2 747位点和nt2 795位点、Ⅱ型病毒的nt2 909位点、Ⅲ型病毒的nt2 636位点,突变发生率分别为34.8%、47.3%、84.8%、53.3%。4个突变热点共有8种核苷酸变异形式,其中3种核苷酸变异形式为转换(Ⅰ型A2795G、Ⅱ型U2909C、Ⅲ型G2636A),另外5种为颠换(Ⅰ型A2747U、A2747C、A2795U和Ⅱ型U2909A、U2909G)。4个突变热点全部导致了编码氨基酸的突变。在编码氨基酸的突变中,除Ⅰ型A2747U、A2 747C、A2 795U导致相似性质的氨基酸之间发生替代外,其余都发生了极性氨基酸和疏水性氨基酸的替换。某些导致不同性质编码氨基酸替换的突变热点同时也是已知的神经毒力决定位点。结论因为有突变热点的存在,说明在VP1区基因中突变的核苷酸并不是完全随机分布的;由于脊灰病毒的VP1区基因突变热点可能与它的生物学特性(如神经毒力)有一定的关联性,因此对VP1区基因突变热点的检测,可作为中国脊灰病毒学监测中的一个重要方法。     

肝豆状核变性患者ATP7B基因8、12号外显子突变的DNA分析

目的 对肝豆状核变性(Wilson disease,WD)ATP7B基因的外显子8、12进行DNA测序分析并建立直接基因诊断方法.方法 102例WD患者和82例对照正常人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B第8、12号外显子,8号外显子及12号外显子扩增产物分别行Msp Ⅰ及Tail内切酶酶切分析;后对所有患者及对照组DNA外显子扩增产物行直接测序.结果 102例WD患者,8号外显子35例存在Msp Ⅰ酶切反应异常,测序示Arg778Leu纯合或杂合突变(占34.31%),其中12例伴Leu770Leu多态性;12号外显子13例存在Tail酶切反应异常,测序示Thr935Met杂合错义突变(占12.75%),1例存在Argg19Gly杂合错义突变,Arg952Lys在患者及对照组中均检出.结论ATPTB基因外显子8、12为WD突变热点,其中8号外显子以Arg778Leu、12号外显子以Thr935Met为主要突变形式,临床上可用PCR-Msp Ⅰ酶切、PCR-Tail酶切反应作为WD患者初步筛选方法.     

中国人群Leber遗传性视神经病变线粒体ND1基因突变频谱分析

背景 Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种常见的遗传性眼病,常导致患者双侧中心视力下降,其基因突变频谱并不完全清楚. 目的 筛查中国人群LHON线粒体ND1基因的突变位点并明确其突变频谱.方法 经温州医学院伦理道德委员会批准,所有受试者知情同意.收集临床诊断为LHON患者894例和正常对照者134名,抽取受检者的外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)法对受检者线粒体ND1基因进行扩增和测序,并与修正的线粒体剑桥参考序列进行比对,筛查突变位点并分析其突变频率.结果 本研究在894例LHON患者的ND1基因中发现了7个与LHON相关的突变位点G3316A、T3394C、G3460A、C3497T、G3635A、G3733A、T4216C,携带这7个位点的患者共100例,占11.19％,其中与3个原发性突变位点共存者29例(3.24％).这几个突变位点在病例中的发生频率分别为2.57％、2.23％、1.45％、3.80％、0.67％、0.11％、0.34％,其中G3316A、T3394C、C3497T、T4216C在正常对照者中也可检测到,分布频率分别为4.48％、2.99％、4.48％和1.49％,经分析在LHON组和正常对照组之间差异均无统计学意义(x2=0.926,P=0.336;x2=0.052,P=0.820;x2=0.142,P=0.707;P=0.129),而其他一些在欧美人群中报道的位点,如G3376A、G3496T、G3700A、A4136G、T4160C、C4171A在中国LHON人群中并未发现. 结论 线粒体ND1基因是中国人群LHON的一个突变热点区域,约11.19％的中国LHON患者与ND1基因突变有关.G3635A、G3733A为中国人群中少见的致病突变位点,而G3316A、T3394C、C3497T、T4216C本身并不足以致病,但可能对LHON外显率和表型的表达起协同作用.     

原发性红斑肢痛症中SCN9A基因的突变热点

目的研究原发性红斑肢痛症1个家系及两个散发病例的SCN9A基因突变情况,探讨该基因的突变热点。方法提取基因组DNA,PCR扩增SCN9A所有外显子并测序,对比分析已报道的SCN9A基因突变。结果在该家系患者发现SCN9A基因突变为C1185G,对应氨基酸改变为N395K,两个散发病例SCN9A基因突变均为T2543C,对应氨基酸改变为I848T;这两个突变位点在既往文献中均有报道。结论SCN9A基因N395K和I848T突变为该家系和散发患者出现临床症状的原因,推测L858,I848和N395可能为该基因的突变热点。     

结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌患者中的突变热点研究

目的探讨结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌中的突变热点及对肿瘤的影响。方法通过公共数据库c Bioportal调取结肠癌突变位点结果,根据其中的一段突变热点区域,构建对应结肠腺瘤样息肉病基因过表达载体及RNAi,采用Western blot检测并证实此区域的功能。结果结肠腺瘤样息肉病基因在结肠癌中的突变率高达73.9%,显著高于其他肿瘤(P<0.05);其中3 454~4 662 bp区域突变发生率占总突变次数的56.1%;构建RNAi后在正常肠上皮细胞中发现β-catenin、CD44、Ki67出现显著上调;在结肠癌细胞中过表达野生型APC(wt-APC),缺失APC(hotdelAPC)的情况下发现,wt-APC可以有效抑制c-myc、β-catenin、CD44、Ki67等致癌基因的表达,但hotdel-APC不能。结论APC基因中3 454~4 662 bp这段区域编码的蛋白可能在结肠癌发生过程中发挥重要作用。     

双错配碱基ARMS结合RE法快速检测FGFR3基因的突变超热点

目的建立快速简便、特异灵敏的鉴定FGFR3基因c．1138G〉A突变超热点的基因诊断方法,为软骨发育不全（ACH）的产前基因诊断或植入前遗传学诊断（PGD）创造条件。方法针对突变率高达95％以上的FGFR3基因的突变热点c．1138G〉A,设计双错配碱基的ARMS特异引物,对已经临床确诊的先证者家系及正常对照和非c．1138G〉A突变的患者对照,分别用普通引物和特异引物进行PCR扩增和直接鉴定,然后对扩增产物进行DNA序列分析及sfcI酶切鉴定。结果用普通引物扩增,对照组和先证者均扩增阳性。sfcI酶切后,对照组仍为一条513bp的带,而患者切出205bp、308bp和513bp三条带;而用ARMS特异引物扩增,则先证者扩增阳性,而对照组扩增阴性,阳性者酶切后产生27bp和418bp两条带。这一切都与预期的结果完全吻合。结论该法快速、特异、准确性高,结合DNA序列分析和酶切鉴定（RE）,可用于ACH高危胎儿的快速产前诊断。     

应用等位基因特异性扩增检测经典型苯丙酮尿症PAH基因第6外显子基因突变

目的建立快速简便、特异灵敏的鉴定PAH基因第6外显子c.611A〉G突变热点的基因诊断方法。方法针对突变频率较高的PAH基因第6外显子的突变热点c.611A〉G,设计等位基因特异性扩增（amplification refractory mutationsystem,ARMS）的特异引物,对山西省已经临床确诊的70例经典型PKU患儿、c.611A〉G突变患儿的家长及50例正常儿童进行第6外显子扩增,扩增产物测序验证。结果在受检的山西省患儿中,PAH基因第6外显子c.611A〉G突变位点ARMS检测结果和测序结果完全相符。结论 ARMS技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为PAH基因热点突变的快速灵敏检测方法。     

Wilson病基因全长外显子的突变检测和分析

目的 研究报道Wilson病（WD）基因7种新突变和5种多态,结合前期在部分外显子发现并报道的突变和多态现象,进一步分析WD基因全长外显子的突变特征,以期对中国人WD基因的突变状况有一个完整的认识。方法 研究对象包括60名无亲缘关系的正常对照和84例分别来自65个家系的WD患者。抽取上述研究对象为外周静脉血,用盐析法或过柱法抽提基因组DNA。用聚合酶链反应方法分别扩增全部的21个外显子顺序,以单链构象多态分析及DNA测序方法,检测上述研究对象的基因突变和多态。结果 共检测到18种突变和17种多成,包括7种突变和5种新多态。其中Arg778Leu和Thr935Met为基因突变热点,突变频率分别高达37．7％和10．0％,其余突变的频率均低于4．0％。此次研究还发现曾作为突变形式加以报道的IIe48Thr应考虑为一种多态现象。结论 我国WD基因突变是是少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征。     

河南省杜氏肌营养不良患者dystrophin基因突变的MLPA检测

目的:探讨多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)在杜氏肌营养不良(DMD)患者基因诊断中的应用价值,了解河南省DMD患者dystrophin基因突变热点.方法:采用MLPA检测48例河南省DMD患者及13例缺失型患者母亲dystrophin基因突变.结果:48例DMD患者中,有31例(64.6％)检测出dystroph...     

地中海贫血基因诊断和产前诊断的研究

目的:建立地中海贫血(地贫)的基因诊断和产前诊断方法,探讨云南人群地贫的基因突变类型。方法:运用多重PCR和PCR-RDB杂交技术对174例疑似患者分别进行α地贫和β地贫的基因诊断,对25例地贫高风险胎儿进行产前诊断。结果:在174例疑似地贫患者中检出地贫基因突变133例,其中α珠蛋白基因突变50例,β珠蛋白基因突变83例;在25例胎儿中检出1例HbH-CS病胎儿、1例HbBart’s胎儿水肿综合征,均诊断后引产,另有6例轻型α地贫携带者胎儿和8例β地贫携带者胎儿足月分娩。结论:应用多重PCR和PCR-RDB技术能够快速、有效地检出76.4%云南地贫疑似病例的基因突变,可作为常规基因诊断和产前诊断方法;云南人群的β地贫基因突变热点及发生率可能与国内其他地区不同,有必要进一步扩大云南的地中海贫血筛查研究。