基于Ion Torrent S5平台的二代测序技术对HLA-DRB1基因分型模棱两可进行分析

目的基于Ion Torrent S5平台NGS法进行HLA-DRB1基因分型检测的模棱两可结果的种类、比例进行分析。方法对471例脐带血造血干细胞库标本采用基于Ion Torrent S5平台的二代测序法检测HLA-DRB1位点,并同步对其中的94例标本采用PCR-SBT测定HLA-DRB1位点,余下377例标本采用PCR-SSO流式磁珠法检测。使用分型软件指定NGS法的HLA-DRB1分型结果,以HLA-DRB1*后第三区的数字作为高分辨水平统计,直接计算法分析模棱两可组合比例。结果标本中470例HLA-DRB1基因NGS检测结果与PCR-SBT法或PCR-SSO法相符合;其中1例标本NGS法漏检一个等位基因,符合率为99.8%。NGS法检测结果中,471例标本中有160例标本HLA-DRB1等位基因型出现模棱两可,比例为33.97%(160/471)。最常见的模棱两可结果组合为DRB1*09∶01∶02/09∶21。结论基于Ion Torrent S5平台的NGS技术可降低HLA-DRB1基因分型的模棱两可结果比例,但仍有一定比例的模棱两可组合结果,同时应注意NGS法检测漏检等位基因的风险。     

The relationship and application between Allele HLA-A*02∶09 and 4 haplotypes

目的 观察等位基因HLA-A*02∶09与4种单倍体的关系,以通过筛检相关单倍体缩小模棱两可确认实验的检测范围.方法 采用PCR-SSO-Luminex方法检测的HLA-A*02∶01和A*02∶09的模棱两可样本通过EXON4-7补充实验确认HLA-A*02∶09阳性样本,并观察是否携带特定单倍体.结果对205例A*02∶01/02∶09的模棱两可样本进行了确认实验,包含携带4种单倍体的样本58例,3例检出A*02∶09;未携带4种单倍体的147例未检出A*02∶09.结论 HLA-A*02∶01/02∶09模棱两可的比例较高,筛检高危单倍体可有效缩小骨髓库入库样本发生A*02∶01/02∶09这一组模棱两可时的确认实验的检测范围.     

AllType NGS11位点测序试剂在HLA-DPB1基因分型中的模棱两可结果分析

目的 统计分析AllType NGS 11位点测序试剂在Ion Torrent S5和Illumina Miseq 2种二代测序平台对HLA-DPB1基因进行分型检测时的模棱两可结果情况。方法 采用One Lambda公司AllType NGS 11位点测序试剂盒检测434个患者或供者标本的HLA-DPB1基因,其中在Ion Torrent S5测序平台上检测了336个标本,在Illumina Miseq测序平台上检测了98个标本;并同步对434份标本采用PCR-SSO流式磁珠法复核HLA-DPB1基因。对HLA-DPB1^*13∶01∶01/107∶01模棱两可等位基因,采用Sanger测序法检测区分。使用TypeStream Visual专业软件指定NGS法的HLA-DPB1基因分型结果,直接计数法统计分析模棱两可组合比例。结果 NGS法以HLA-DPB1命名*后第3区域数字作为高分辨结果进行统计,434个标本中共有357个标本出现模棱两可结果,占82.3%(357/434);其中Ion Torrent S5测序平台336个标本有275个标本存在模棱两可结果,占...     

陕西地区10165例造血干细胞捐献者HLA-A／B／DRBl座位罕见等位基因确认与分析

本研究分析陕西地区2009-2012年度10165例造血干细胞捐献者HLA-A／B／DRBl分型中罕见等位基因的检出状况。应用PCR-SBT方法对10165陕西地区造血干细胞捐献者的HLA-A／B／DRBl进行分型。结果发现,在48例捐献者中确认罕见等位基因40种,其中在15个捐献者中确认的10种等住基因虽不包含在中华骨髓库的常见及确认等位基因表（common allelesandwelldoeumemedalleles,CWD）中,但已包含在美国免疫遗传协会的常见及确认的等位基因表中,分别是：A＊02：04、B＊07：10、B＊27：09、B＊35：11、B＊44：29、DRB1＊03：04、DRB1＊08：18、DRB1＊13：05、DRB1＊13：14、DRB1＊14：11,检出2例以上的罕见等位基因包括A＊68：24、B＊35：11、B＊44：29、DRB1＊03：04、DRB1＊08：18、DRB1＊13：05。本实验室从2005-2012年发现并被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会命名的共21例新的HIA等位基因中,有些在多个实验室的多个个体被确认,现已有HLA-A＊02：90、HLA-B＊48：14、HLA-DRB1＊01：14被列入中华骨髓库的确认及常见等位基因表。结论：在实际工作中,对于发现的新等位基因要及时上报,对确认的罕见等位基因要记录统计,保证中华骨髓库HLA基因人群分布不断累积和多态性完整,给修正中国CWD表提供依据。在参照常见及确认等位基因表进行实验分析时,对于模棱两可样本含有已确认过的罕见等位基因时要慎重取舍,以避免错检或漏检发生,保证患者尤其是携带罕见等位基因的患者最大可能的找到匹配的供者。     

等位基因HLA-A*02∶09与4种HLA单倍体的关系及应用

目的 观察等位基因HLA-A＊02∶09与4种单倍体的关系,以通过筛检相关单倍体缩小模棱两可确认实验的检测范围.方法 采用PCR-SSO-Luminex方法检测的HLA-A＊02∶01和A＊02∶09的模棱两可样本通过EXON4-7补充实验确认HLA-A＊02∶09阳性样本,并观察是否携带特定单倍体.结果对205例A＊02∶01/02∶09的模棱两可样本进行了确认实验,包含携带4种单倍体的样本58例,3例检出A＊02∶09;未携带4种单倍体的147例未检出A＊02∶09.结论 HLA-A＊02∶01/02∶09模棱两可的比例较高,筛检高危单倍体可有效缩小骨髓库入库样本发生A＊02∶01/02∶09这一组模棱两可时的确认实验的检测范围.     

PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A*02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析

背景:由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象.目的:统计分析基于PCR-SSO 流式荧光微珠HLA-A*02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例.方法:对河南骨髓库捐献者 1 100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A*02:01\02:09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A*02:09的基因多态性分布进行比对,找出与A*02:09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A*02:01\02:09模棱两可组合的判读方法.结果与结论:1 039例有效数据中包含A*02:01\02:09模棱两可组合279例(279/1 039,26.853%),代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A*0209的基因多态性统计显示A*0209的出现与A*11:01 (0.147 1)B*07:02(0.264 7)、DRB1*01:01(0.264 7 )、DRB1*03:01(0.117 6)有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1~7,并用SBT复核确认有1例结果为A*02:09(代码组合为GMDC),其余241例未检出A*02:09.提示 A*02:09的出现与B*07:02、DRB1*01:01、DRB1*03:01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1~7检测,可有效地检出A*02:09.通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例.     

人类白细胞抗原A、B和DRB1测序分型模棱两可结果的分布及解决

目的 调查广西人群HLA-A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况,提出解决方案.方法 采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对1 000名中华骨髓库广西分库供者的HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型,分析3个基因座模棱两可分型结果的分布情况,并分别采用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法和组特异性测序引物法进行解决.结果 1 000份标本中,96.7％的标本HLA-A、B、DRB1基因至少有1个位点出现模棱两可结果,其中HLA-A、B、DRB1各位点出现模棱两可结果的比例分别为65.7％、58.8％、77.2％％.对于检出的模棱两可结果标本,单独采用组特异性测序引物法可以解决87.37％HLA-A、93.54％ HLA-B和60.49％的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,使用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决12.63％ HLA-A、4.76％ HLA-B和15.29％ HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,剩余1.70％ HLA-B和24.22％的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果联合使用组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决.结论 组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法分别对位于HLA-A、B和HLA-DRB1基因检测区内、外的模棱两可分型结果具有较高的解决能力,二者互为补充,可有效解决HLA高分辨基因分型结果模棱两可问题.     

中国人群人类白细胞抗原A、B和DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的鉴别

背景：人类白细胞抗原基因测序分型中，当某些等位基因间的差异碱基位于测序范围外时，无法得到清晰的等位基因结果。 目的：分析中国人群人类白细胞抗原A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的分布规律，探讨其在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原 A、B、DRB1基因的测序分型中的解决方案。 设计、时间及地点：采用随机抽样方法对研究样本进行人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型，并对其中的模棱两可等位基因进行验证性实验，于2006-01/2008-06在深圳市血液中心完成。 材料：658名深圳骨髓库汉族供者乙二胺四乙酸盐抗凝血5 mL。 方法：采用聚合酶链式反应--测序分型方法对658名深圳骨髓库供者的人类白细胞抗原A、B和DRB1基因进行高分辨分型，并采用针对相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物方法对其中由于碱基差异位于检测区外而产生的模棱两可等位基因进行鉴别。 主要观察指标：模棱两可等位基因的分布及确认。 结果：658份标本中，人类白细胞抗原A、B和DRB1三个基因座的模棱两可等位基因分别为9个(2种)、140个(5种)、406个(8种)，占等位基因总数的14.06%(555/3 948)。高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物鉴定结果显示，中国报道的DRB1*1401被全部确认为DRB1*1454；12例B*0705/B*0706中，有1例被确认为B*0706，其他13种等位基因的鉴定结果分别为A*6801、A*7402、B*2705、B*3501、B*4402、B*5801、DRB1*0101、DRB1*0406 、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1201、DRB1*1302 和DRB1*1502。 结论：在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原基因的测序分型中可以应用直接鉴别的方法区分模棱两可等位基因，但在临床移植前的高分辨确认试验中则需要采用实验方法进行精确分型。     

中国人群人类白细胞抗原A、B和DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的鉴别

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当某些等位基因间的差异碱基位于测序范围外时,无法得到清晰的等位基因结果.目的:分析中国人群人类白细胞抗原A,B,DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的分布规律,探讨其在中华骨髓库大样本人类自细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型中的解决方案.设计、时间及地点:采用随机抽样方法对研究样本进行人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型,并对其中的模棱两可等位基因进行验证性实验,于2006-01/2008-06在深圳市血液中心完成.材料:658名深圳骨髓库汉族供者乙二胺四乙酸盐抗凝血5 mL.方法:采用聚合酶链式反应-测序分型方法对658名深圳骨髓库供者的人类白细胞抗原A、B和DRB1基因进行高分辨分型,并采用针对相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物方法对其中由于碱基差异位于检测区外而产生的模棱两可等位基因进行鉴别.主要观察指标:模棱两可等位基因的分布及确认.结果:658份标本中,人类白细胞抗原A、B和DRB1三个基因座的模棱两可等位基因分别为9个(2种)、140个(5种)、406个(8种),占等位基因总数的14.06%(565/3 948).高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物鉴定结果显示,中国报道的DRB1*1401被全部确认为DRB1*1454;12例B*0705/B*0706中,有1例被确认为B*0706,其他13种等位基因的鉴定结果分别为A*6801、A*7402、B*2705、B*3501、B*4402、B*5801、DRB1*0101、DRB1*0406、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1201、DRB1*1302和DRB1*1502.结论:在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原基因的测序分型中可以应用直接鉴别的方法区分模棱两可等位基因,但在临床移植前的高分辨确认试验中则需要采用实验方法进行精确分型.     

中国南方汉族人群HLA-A，B，DRB1基因测序分型模棱两可结果的分布及其解决方案

背景：聚合酶链式反应-直接测序分型技术被誉为HLA分型的金标准，在临床移植配型和骨髓库供者的大规模HLA分型中逐渐被广泛采用，但该方法的最大缺点是存在较高比例的模棱两可分型结果，故亟待寻找并建立适合中华骨髓库大规模供者HLA-测序模棱两可分型结果的解决方案。 目的：调查中国南方汉族人群HLA-A，B，DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况，评估其可能的解决方案。 设计、时间及地点：观察测量实验，2007-08/2008-08在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室完成。 对象：选择深圳骨髓库的汉族骨髓供者416名，供者民族和籍贯按照自述原则确定。 方法：采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对416名汉族供者的HLA-A，B，DRB1基因进行测序分型，分析3个基因座模棱两可分型结果的分布情况，并分别采用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法和杂合性模棱两可引物分离法进行解决；采用直接计数法统计基因频率，计算真实等位基因的相对概率。 主要观察指标：416名供者HLA-A，B，DRB1基因直接测序分型结果的分布。HLA-A，B，DRB1基因测序模棱两可分型结果的分类及分布。序列特异性引物法及杂合性模棱两可引物分离法对模棱两可分型结果的解决能力。 结果：80.29%的标本其HLA-A，B，DRB1基因出现模棱两可结果。80%左右的HLA-A，B基因和不足40%的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果可以采用杂合性模棱两可引物分离法解决，其他则需要高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决。根据等位基因频率计算553个模棱两可等位基因组合中，75%的真实等位基因组合的相对概率大于98%。 结论：杂合性模棱两可引物分离法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法分别对位于HLA-A，B和HLA-DRB1基因检测区内、外的模棱两可分型结果具有较高的解决能力，二者互为补充；在大规模供者HLA分型中应用频率数据解决模棱两可结果有一定的应用价值。