大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架的体外生物相容性研究

目的：探讨大鼠牙源性上皮细胞（rDECs）、牙源性间充质细胞（rDMCs）分层复合纳米羟基磷灰石-胶原/聚乳酸（nHAC/PLA）支架共生长的生物相容性.方法：①.应用酶消化法和差速消化法分离培养rDECs和rDMCs,经cytokeratin、vimentin免疫荧光染色鉴定其来源.②.应用扫描电镜观测rDECs、rDMCs分层复合nHAC/PLA支架后的生物相容性.结果：①.成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和间充质细胞,免疫荧光染色鉴定rDECs、rDMCs分别表达cytokeratin、vimentin,证明rDECs、rDMCs分别来源于牙源性上皮组织、中胚层间充质.②.扫描电镜显示：rDECs、rDMCs复合nHAC/PLA共培养5d后,椭圆形的rDECs和长梭形的rDMCs胞体充分伸展,胞质中胶原纤维和基质分泌丰富,细胞与支架相互交织成网状.10d后,rDECs、rDMCs胞质中基质分泌更加丰富,覆盖部分细胞,并与支架相融合.结论：rDECs、rDMCs在nHAC/PLA支架上增殖、分化旺盛,具有良好的生物相容性.     

不同因子对大鼠牙源性间充质细胞成牙本质分化的影响

目的： 探讨bFGF、IGF1、BMP4、TGF-β1联合应用对大鼠牙源性间充质细胞（rat dental mesenchymal cells, rDMCs）成牙本质分化的影响。方法：应用酶消化法和差速消化法分离、培养大鼠牙源性上皮细胞（rDECs）和rDMCs,经cytokeratin、vimentin免疫荧光染色鉴定其来源。应用茜素红染色、Gomori钙-钴法检测矿化液诱导下rDMCs的矿化能力。应用免疫组织化学染色、图像分析、实时荧光定量PCR和Western 印迹法检测在bFGF+IGF1（组1）、TGF-β1+BMP4（组2）、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4（组3）分别诱导下 rDMCs中DSPP、CAP、OPN、OCN的表达差异。采用SPSS14.0软件包对数据进行统计学分析。结果：成功分离培养、鉴定rDECs和rDMCs,经矿化液诱导后的rDMCs钙结节和ALP染色阳性。组1、2中,DSPP、CAP、OPN、OCN mRNA和蛋白的表达水平均显著高于空白对照组4,差异显著（P<0.01）,其中组1 CAP、OCN和组2 DSPP、OPN的表达水平最高。结论：rDMCs经矿化诱导后具有成骨特性。bFGF+IGF1显著促进CAP、OCN的表达,加速rDMCs向成牙骨质细胞、成骨细胞分化与牙骨质基质、骨基质的矿化;TGF-β1+BMP4显著促进DSPP、OPN的表达,加速rDMCs向成牙本质细胞、成骨细胞分化与牙本质基质、骨基质的矿化,显示其成骨趋向。4种因子联合应用,并不具备显著的协同作用。     

大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架体内构建牙体组织-骨复合体样结构的研究

目的: 探讨不同组合生长因子诱导的大鼠牙源性上皮细胞(rDECs)、间充质细胞(rDMCs)复合nHAC/PLA支架体内形成牙体组织-骨复合体样结构的能力。方法: 应用酶消化法和差速消化法分离培养rDECs和rDMCs,免疫荧光染色鉴定其来源。将各组细胞-支架复合物移植裸鼠皮下3月、5月后分别取材,检测移植物形成牙体组织-骨复合体样结构能力。结果: 成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和间充质细胞。细胞-支架复合物移植后3月,组①、②、③在细胞-支架接触部位均发现类骨质、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的阳性表达。组②促成骨作用最强。对照组④没有新生骨形成,仅有少量胶原纤维和血管。移植后5月,组①、③均形成没有髓腔的牙根样结构,部分区域有DSPP、DMP1、CAP表达。组②形成周边有新生骨、中央有单根牙体样组织,中心为含有牙髓样组织和血管的髓腔样结构,并有DSPP、DMP1、OPN、OCN在髓腔内壁牙本质基质、部分牙髓样组织和血管内的阳性表达,ameloblastin、CAP分别在釉质样、牙骨质样组织中表达阳性。对照组④形成新生骨,OCN强阳性表达,未形成牙体样结构。结论: 经TGF-β1+BMP4诱导的rDECs + rDMCs-nHAC/PLA体内移植物促成骨和成牙作用最强,移植后5月形成牙体组织-骨复合体样结构。