转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化

背景：研究表明转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化具有显著的诱导作用。周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境,对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用。目的：探讨转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。方法：取2月龄新西兰大白兔10只,骨穿针穿入股骨髓腔内,抽取骨髓3.0-4.0 mL并分离培养骨髓间充质干细胞,传至3代后随机分为4组,分别为空白组、转化生长因子β组、周期性拉伸应变组以及周期性拉伸应变＋转化生长因子β组,作用1,3,6 d后取出相应细胞,番红O染色观察大体形态,阿尔新蓝染色检测糖胺聚糖水平,ELISA检测上清液基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1 mRNA相对表达量。结果与结论：番红O染色可见细胞呈长梭形或不规则三角形样改变,各实验组较空白组细胞数量及基质分泌增多。作用第3天时转化生长因子β组、周期性拉伸应变＋转化生长因子β组上清液糖胺聚糖水平较空白组均升高（P＜0.05）,周期性拉伸应变＋转化生长因子β组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量较空白组增高（P ＜0.05）。结果提示转化生长因子β及周期性拉伸应变均可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,二者具有明显的协同作用。     

激光免疫测定拉伸应变和加载时间对人牙周膜成纤维细胞形态和骨架的影响

通过体外人工培养人牙周膜成纤维细胞，对其施加不同时间不同值的机械拉仲应力应变，用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术观察其结构变化情况，寻求应力应变和时间与细胞形态、骨架的关系。结果发现在应变值为0、0．8％、12％、16％各组，细胞和细胞核投影面积与加力时间和应变值呈正比；细胞骨架随着应变值的增加和加力时闻的延长而逐渐增粗、密度增加，排列更有规律；在应变值20％组，细胞和细胞核投影面积随着加力时间的增加而逐渐减少，细胞骨架结构变得模糊和紊乱，说明在机械拉仲应力应变作用下，人牙周膜成纤维细胞的形态和骨架发生了规律的改变。     

机械拉伸对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响

目的：研究拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞I型胶原及蛋白合成的影响。方法：应用酶联免疫吸附实验及考马斯亮蓝微板法对拉伸应变下的细胞合成代谢变化进行观察,应变范围为1－8％,结果：在0．5－8％拉伸应变范围内,人牙周膜成纤维细胞I型胶原合成无明显变化,但1－8％拉伸应变作用下细胞蛋白合成减少,其中2％拉伸应变影响最明显。结论：拉伸应变可改变人牙周膜成纤维细胞细胞外基质成分。     

基底拉伸应变对小鼠成骨细胞Runx2表达的影响

目的研究基底拉伸应变对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞Runx2表达的影响。方法实验随机分为0με、1000με、1500με、2000με、2500με、5000με六组,采用卫生装备研究所自行研制的细胞基底应变加载装置对细胞进行加载,Western blot检测不同应变对成骨细胞Runx2蛋白表达的影响。此外采用Real-time PCR检测0με、2500με、5000με三种强度应变对成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响。结果 Western blot结果显示:1500με、2000με、2500με组与0με组相比Runx2蛋白表达显著增强(P<0.01);5000με组与0με组相比Runx2蛋白表达显著降低(P<0.01);Real-timePCR结果显示:2500με组与0με组相比Runx2 mRNA表达显著降低(P<0.01);5000με组与0με组相比Runx2 mRNA表达显著增加(P<0.01)。结论①生理强度的拉伸应变可显著增加MC3T3-E1细胞Runx2蛋白的表达,并且呈剂量依赖性,超生理强度5000με显著降低Runx2蛋白表达。②同样强度的拉伸应变刺激下,Runx2基因表达与蛋白表达并不一致。     

频率对拉伸应变诱导成骨细胞凋亡的影响

目的考察频率对拉伸应变诱导成骨细胞凋亡的影响。方法采用Flexcell力学加载系统对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1施加1%双轴拉伸应变刺激,频率分别为1、2、3、4、5 Hz,每天加载1 h,间歇性拉伸8 d;通过测定乳酸脱氢酶(LDH)活性检测细胞死亡率;采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术观察细胞凋亡情况;实时PCR检测细胞凋亡标志基因caspase-3、-9以及Bcl-2、Bax基因水平;Western blotting检测caspase-3、-9蛋白表达。结果不同加载频率对成骨细胞LDH活性无影响;不同频率下流式细胞术总体凋亡率无显著性差异,但是2 Hz频率可诱导成骨细胞早期凋亡。2 Hz拉伸应变可明显上调caspase-3、-9基因和蛋白表达,上调Bax/Bcl2蛋白比值。结论 1%双轴拉伸应变刺激下1~5 Hz频率不能引起成骨细胞凋亡和死亡,但2 Hz频率可诱导成骨细胞早期凋亡,且通过上调Bax/Bcl-2表达实现的。     

静态机械拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2分泌量的影响

目的：研究静态机械拉伸应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2(PGE2)分泌量的影响。方法：实验的拉伸应变量设为0％、8％、12％、16％、20％5种，加力时间为24、48、72h3种，总共分为15组，每组设3个样本。加力完毕后，用RIA ELISA法分析每个样本培养基中PGE2的含量并进行统计分析。结果：在0％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间无关；在8％、12％、16％力值组，PGE2的每天分泌量随着加力时间和力值的增加而递增，但每天递增量随着加力时间的增加而减少；在20％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间成反比；在各个时间组，PGE2的每天分泌量均在16％力值处达到最高值。结论：在细胞的生理应变承受范围(0％、8％、12％、16％)内，静态机械拉伸应变促进人牙周膜成纤维细胞PGE2的分泌，但刺激效应随着加力时间的增加而减少；当拉伸应变量超过了细胞的生理应变承受范围(20％)．则PGE2的分泌量会随着加力时间的增加而减少。     

不同波形的周期性机械拉伸对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响

目的研究不同波形的周期性机械拉伸对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响。方法应用Flexercell4000加载系统对拉伸应变下细胞增殖动力学变化进行分析。结果在应变为15%,频率为30次/min,加载时间为2h下,不同波形的拉伸刺激对细胞增殖的影响不同。其中方波组细胞生长明显受抑。结论施加方波的周期性机械拉伸可能对肺腺癌细胞增殖有抑制作用。     

基底拉伸应变对小鼠三种骨组织细胞BMP-2 mRNA表达的影响

目的研究基底拉伸应变对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1、破骨细胞系RAW264.7及骨细胞MLO-Y4三种细胞BMP-2mRNA表达的影响。方法三种细胞随机分为0με、1000με、1500με、2000με、2500με和5000με组,最佳拉伸时间和周期为1次/d,每次1h,连续3d,频率为0.5Hz。采用卫生装备研究所自行设计研制的四点弯曲装置对小鼠三种细胞进行拉伸加载。采用RT-PCR技术分别研究不同应变对小鼠三种细胞BMP-2mRNA表达。结果 MC3T3-E1细胞RT-PCR结果显示:1500με、2000με组和2500με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著增强(P0.01);5000με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P0.01);RAW264.7细胞RT-PCR结果显示:1500με、2000με组和2500με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P0.01);5000με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P0.01);MLO-Y4细胞BMP2基因表达结果与MC3T3-E1一致。结论①BMP-2在成骨细胞系MC3T3-E1、破骨细胞系RAW-264.7及骨细胞系MLO-Y4三种细胞中均有表达;②1500με、2000με、2500με三种生理剂量的拉伸应变可以显著增加MC3T3-E1、MLO-Y4细胞BMP-2的表达,并呈剂量依赖性,超生理剂量5000με可以显著降低MC3T3-E1、MLO-Y4细胞BMP-2的表达;③相同的力学拉伸作用条件下,BMP-2在RAW-264.7细胞中表达与MC3T3-E1、MLO-Y4细胞的表达趋势相反。     

拉伸应变和加载时间对人牙周膜成纤维细胞IL-1β分泌量的影响

研究拉伸应变和加载时间对体外培养人牙周膜成纤维细胞（PDLF）的白细胞介素-1β（IL-1β）分泌量的影响，将原代，传代培养成功的PDLF制备成实验用细胞，分为5组（n=3)，而后分别置于特制的加力装置上拉伸加载，加力至拉伸应变量分别为0%，8%，12%，16%和20%，加力时间为24，48，72h。用双抗ELISA法分析IL-1β的含量。结果表明，8%，12%和16%拉伸应变组IL-1β的分泌量随着加力时间和力值的增加而递增；在各个时间组，IL-1β分泌量在16%应变值外达到最高值；20%拉伸应变组，加力24h和48h,IL-1β分泌量明显高于0%应变组，与12%和16%应变组相比已开始下降，加力72h,IL-1β分泌量大幅度下降，已低于对应的0%应变组，在细胞生理应变承受范围内，静态机械拉伸应变能促进人牙周膜成纤维细胞IL-1β的分泌，但刺激效应随着加力时间的增加而减少。     

重复性机械拉伸肌腱成纤维细胞与前列腺素E2和白三烯B4水平异常升高的关系

目的探讨机械拉伸肌腱成纤维细胞导致的前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)水平升高与肌腱腱病的关系. 方法应用改进的细胞培养、拉伸系统,把人肌腱成纤维细胞种植于有微型沟槽的可变形硅胶盘中,分别在不同的拉伸应变(4%、 8%、 12%)下进行单轴、重复性机械拉伸.非拉伸组设为对照.检测PGE2 和LTB4水平以及相关酶[环氧化酶(COX)、5脂加氧酶(5-LO)]的变化. 结果拉伸肌腱成纤维细胞可产生高水平的PGE2和LTB4,其产生量与拉伸应变有关.阻断COX可减少PGE2的产生,但产生更多的LTB4,反之亦然. 结论重复拉伸肌腱成纤维细胞产生高水平的PGE2 和LTB4,并且其二者存在平衡关系.临床上应慎用非甾体类抗炎药治疗肌腱腱病.