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目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础 相似文献
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用RT-PCR方法从活化的人外周淋巴细胞中分离了人白17基因,序列分析结果表明与文献报道的完全相符,以质粒pBV220为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了hIL-17基因,重组蛋白以包涵体的形式存在,约占菌体总蛋白的量40%。 相似文献
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BACKGROUND: Xenotransplantation provides a possible solution to the severe shortage of allogeneic organ donors. The pig, which shares many physiological similarities with humans, makes it an optimal species for preclinical experimentation and clinical applications. Interleukin 2 (IL2) is a potent growth factor secreted primarily by T helper lymphocytes and it is vital to the cellular expansion required for a productive immune response and the development and peripheral expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells. Therefore, it is essential to understand of the compatibility of IL2 between pigs and humans. METHODS: We first compared the cDNA and protein sequences and the crystal structures of human and porcine IL2 and IL2 receptors, respectively. The effect of IL2 to induce T cell proliferation was determined by 3H-thymidine incorporation and cell cycle detection. RESULTS: Porcine IL2 induced very limited proliferation of human lymphocytes while it functioned well on porcine lymphocytes. Human IL2 had remarkably reduced effects on porcine lymphocytes whereas it worked well on human lymphocytes. CONCLUSION: Our present study showed that the interaction of IL2 and IL2R across species might have defects. Together with the wide physiological functions of IL2, our data indicated that physiological disorders could be caused by the poor function of xenogeneic donor IL2 on host cells in full hematopoietic chimera. Our data suggested an additional potential advantage for the mixed xenogeneic chimeras. 相似文献
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目的:通过错配PCR技术提高1株人源化抗hIL17A单链抗体(scFv)的亲和力,为进一步开发治疗类风湿性关节炎(RA)的人源化抗体药物奠定基础。方法:本研究采用错配PCR和重叠PCR的方法,对抗体的重链、轻链可变区分别随机引入突变,并将细菌内膜展示技术和流式细胞技术(FCM)相结合进行高通量筛选,获得高亲和力突变株。由于hIL17A能刺激HeLa细胞产生白细胞介素IL-6和IL-8,因此scFv突变株经表达纯化后,利用real-time PCR技术在mRNA转录水平上检测其阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力。结果:筛选出5株突变株,经流式细胞仪检测其中有3株亲和力与亲本相比有很大程度的提高,2株与亲本相当,而且所有突变株均保留了亲本与hIL17A的结合能力,经real-time PCR检测证明这5株突变株均有阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力,突变株的亲和力与中和效果成正比。结论:错配PCR技术是抗体体外亲和力提高的一种可行性方法,在保证与抗原结合能力的基础上提高了其亲和力和中和活性。该实验结果为RA的靶向治疗提供了候选药物,而且也为抗体的体外亲和力的提高提供了参考方法。 相似文献
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IL15是一种促进T细胞、B细胞和NK细胞生长和分化的细胞因子。本文用RTPCR方法,自行设计并合成两对引物,成功地从成人脾脏中扩增出hIL15cDNA,并定向克隆入pUC19载体中。经序列测定证实,为hIL15成熟肽cDNA基因。hIL15基因的获得,为进一步在大肠杆菌中高效表达有活性的重组IL15,更深入地研究其作用机理,以及临床应用奠定了基础。 相似文献
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目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。 相似文献
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应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因 总被引:9,自引:0,他引:9
目的 构建人单链白细胞介素12(hscIL-12)融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究hscIL-12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组PCR技术将hIL-12p40和p35亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3碱基序列进行前后拼拼(IL-12p40-多肽接头-p35),构建hscIL-12融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将hscIL-12融合基因插入pcDNA3.1真核表达载体中,转染COS-7细胞表达hscIL-12融合蛋白,并行Western blot分析。结果 该融合基因经DNA序列分析表明:p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在COS-7细胞中表达hscIL-12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子 相似文献
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重组免疫毒素hIL2-Luffin P1对Hut-78细胞增殖及凋亡的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的观察并评价重组免疫毒素hIL2-Luffin P1对皮肤T细胞淋巴瘤细胞(Hut-78)增殖和凋亡的影响。方法IL-2受体α链(CD25)抗体通过免疫细胞化学技术检测Hut-78细胞表面CD25分子的表达。将不同浓度hIL2-Luffin P1分别处理Hut-78细胞,用MTT法检测细胞增殖的抑制率,以Annexin V/PI双标法流式细胞术检测Hut-78细胞的凋亡。结果CD25在Hut-78细胞表面表达阳性率为79.32%。经浓度为0.5、1、10、20、30和40μg/mL的hIL2-Luffin P1作用48h,其对Hut-78细胞增殖的抑制率分别为11.03±1.604、19.21±1.577、32.41±1.744、42.37±1.289、52.80±2.031、59.33±1.261。经浓度为1、10、30μg/mL的hIL2-Luffin P1作用48h,Hut-78细胞的凋亡率分别为8.23±1.29、15.37士0.98和27.33±1.06。结论hIL2-Luffin P1能够抑制Hut-78细胞的增殖并能诱导凋亡。这提示重组免疫毒素hIL2-Luffin P1对具有IL-2受体表达的皮肤T细胞淋巴瘤可能具有潜在治疗作用。 相似文献