MCP、血管内皮抑素抑制结肠癌肝转移的作用研究

目的修饰柑橘果胶(modified citrus pectin,MCP)和血管内皮抑素(endostatin,ES)已分别被证实能通过不同机制抑制肿瘤转移的形成。探讨不同浓度的MCP及与ES联用后对小鼠结肠癌肝转移的抑制作用。方法经小鼠脾脏下极包膜注入CT-26结肠癌细胞建立结肠癌肝转移模型。135只Balb/c小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量MCP组、中剂量MCP组、高剂量MCP组、ES组、低浓度MCP ES组、中浓度MCP ES组和高浓度MCP ES组。MCP加入饮用水中,各组浓度分别为0、0、0.01、0.025、0.05、0、0.01、0.025及0.05g/L,ES剂量均为2mg/kg,腹腔内给药,隔天1次。3周后观察各组小鼠肝转移情况。制作肝转移瘤组织芯片,用免疫组化方法检测肝转移瘤组织中galectin-3、VEGF的表达和肿瘤微血管密度(MVD),采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测小鼠血清galectin-3和VEGF浓度。结果(1)除阴性对照组外,各组肝转移率分别为100.0、80.0、73.3、60.0、86.7、73.3、73.3和60.0。高浓度MCP组、中浓度MCP ES组、高浓度MCP ES组与阳性对照组比较,肝转移灶数目均明显减少(P<0.05);高浓度MCP ES组与ES组比较,肝转移灶数目明显减少(P<0.05)。(2)除阴性对照组外,各组脾脏种植瘤体积中位数分别为1.51cm3、0.93cm3、0.77cm3、0.70cm3、1.25cm3、1.15cm3、0.75cm3和0.67cm3。中浓度MCP组、高浓度MCP组、中浓度MCP ES组、高浓度MCP ES组与阳性对照组比较,脾脏种植瘤体积均明显缩小(P<0.05)。(3)各组肝转移瘤galectin-3、VEGF表达相互间比较无明显差异(P值均>0.05)。(4)阳性对照组和各治疗组的血清galectin-3、VEGF浓度均明显高于阴性对照组(P值<0.01);阳性对照组与各治疗组相互间比较无明显差异(P值均>0.05)。(5)各组肝转移瘤MVD分别为28.47±3.22、27.47±3.22、26.92±1.47、26.91±2.41、26.43±1.47、26.50±3.09、25.45±1.96和24.73±3.09,各浓度MCP ES组肝转移瘤MVD计数与阳性对照组比较均有明显减少(P值均<0.05)。结论单用MCP或与ES联用均能有效抑制结肠癌肝转移和微血管生成。     

人血管内皮抑素腺相关病毒载体包装质粒0pSNAV-hEndostatin-CMV-EGFP的构建

目的:构建人血管内皮抑素(Endostatin)腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体包装质粒pSNAV-hEndostatin-CMV-EGFP.方法:采用分子克隆技术,从pCD-sEndostatin质粒获得hEndostatin cDNA,并将PCR扩增产物插入至AAV包装质粒pSNAV上,构建pSNAV-hEndostatin-CMV-EGFP的AAV重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定.结果:经PCR、酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hEndostatin-CMV-EGFP构建成功.结论:构建的AAV包装质粒pSNAV-hEndostatin-CMV-EGFP可作为rAAV-hEndostatin-EGFP表达载体的包装质粒.     

鸡胚尿囊膜黑色素移植瘤模型中微循环模式药物干预观察

目的:观察内皮抑素和多西环素对鸡胚尿囊膜黑色素移植瘤模型中不同微循环模式的影响,为黑色素瘤临床治疗提供实验依据.方法:分别于瘤细胞接种后3 d(A组)和5 d(B组)给予内皮抑素干预,于瘤细胞接种后3 d(C组)和5 d(D组)给予多西环素干预,给予无菌PBS溶液干预为对照组(E组),用HE和免疫组织化学染色的方法观察移植瘤中不同微循环模式面积的变化.结果:与E组比较,A组和B组移植瘤内内皮依赖性血管面积减小(P ＜ 0.01),A组血管生成拟态的面积增加(P ＜ 0.05);D组移植瘤内内皮依赖性血管和血管生成拟态的面积减少(P ＜ 0.05).结论:内皮抑素能抑制内皮依赖性血管的生成,但不能抑制血管生成拟态的形成,而多西环素能同时抑制内皮依赖性血管和血管生成拟态的形成.     

恩度联合化疗治疗恶性肿瘤20例报告

探讨重组人血管内皮抑素注射液(恩度,YH-16)联合化疗治疗多种晚期恶性肿瘤的疗效及不良反应。20例经病理或细胞学检查确诊的恶性肿瘤患者,采用恩度联合化疗治疗,将恩度15mg加入NS250mL或500mL中匀速静脉滴入,d1～d14,同时联合化疗。每21d为1个周期。20例患者中,仅1例肺癌患者因经济受限仅完成1个周期的联合治疗,其余19例均完成2～6个周期的治疗,周期数为48个,平均2.5个。19例可评价患者中,PR3例,SD14例,PD2例,RR15.8%(3/19),疾病控制率89.5%(17/19)。生活质量改善13例,稳定3例,下降3例。G3/4毒副反应,主要有3例骨髓抑制,恶心呕吐及腹泻各1例。初步研究结果提示,恩度与化疗联合可以显著提高患者生活质量,并可提高疗效,毒副反应没有增加。     

重组人血管内皮细胞抑制因子对犬的长期毒性研究

目的 评价重组人血管内皮细胞抑制因子(endostatin)注射液的长期毒性作用,为临床试验提供安全性依据.方法 将24只纯种Beagle犬随机分为4组,每组6只,雌雄各半,其中一组为空白对照组,另3组分别按1.6mg/kg、6.3mg/kg和25.0mg/kg静脉注射endostatin注射液,每天注射1次,连续3个月,观察犬的一般毒性反应、体重、心电图、血液学、血清生化学、尿常规及病理组织学等指标.结果 在给药早期见高剂量组一犬出现食欲减退、轻度腹泻等症状.这些症状持续4天左右自行消失.各剂量组犬的体重增长正常,心电图导联Ⅱ、血液学、血清生化学、尿常规等指标均在正常范围内.病理组织学检查见低剂量组和空白对照组各有一犬的肝、肾组织有不同程度的病理改变,分析这些病理改变为犬的自发性病变,与该药物的使用、剂量无关.结论 在此试验条件下,endostatin注射液静脉注射给药3个月对Beagle犬的无毒剂量为6.3mg/kg.     

恩度联合第3代含铂化疗方案治疗55例晚期非小细胞肺癌的临床观察

目的:观察重组人血管内皮抑制素恩度联合第3代含铂化疗方案治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的疗效、中位无进展生存(progression-free survival, PFS)时间和不良反应.方法:55例晚期NSCLC患者接受恩度联合第3代含铂化疗方案治疗,化疗至少2个周期以上.观察指标包括PFS、总有效率(response rate, RR)、临床获益率(clinical benefit rate, CBR)和不良反应.结果:在51例可评价疗效的患者中,15例(29.4%)获得部分缓解,27例(52.9%)为疾病稳定,9例(17.6%)为疾病进展,无完全缓解患者;RR为29.4%(15/51),CBR为82.4%(42/51).所有55例患者的中位PFS为6.3个月.不同病理类型(P = 0.370)、初治与复治(P = 0.101)、不同化疗方案(P = 0.232)患者的近期疗效差异无统计学意义,PFS差异也无统计学意义.研究期间总的白细胞和血小板下降率分别为72.7%和54.5%,Ⅲ～Ⅳ度白细胞和血小板计数下降率分别为36.4%和21.8%.有4例患者因不良反应退出研究,其中1例患者因消化管出血而死亡,1例患者发生Ⅲ度血压升高而未得到控制,1例患者发生室上性心率失常,1例患者发生Ⅳ度肝功能异常.结论:恩度联合第3代含铂化疗方案治疗晚期NSCLC的近期CBR较高,PFS有所延长,不良反应尚能耐受.     

载体肝干细胞分泌表达的Endostatin对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的观察携带内皮抑素基因的载体肝干细胞分泌表达的内皮抑素蛋白（Endostatin，ES）对血管内皮细胞体外增殖和凋亡的影响。方法体外扩增培养本室构建的携带内皮抑素基因的载体肝干细胞WB-ES，收集合有分泌型Endostatin的上清液。将人脐静脉内皮细胞ECV304体外增殖培养，加入不同浓度的含倍比稀释Endostatin的上清液，在不同的作用时间（24、48、72h），通过四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞生长抑制率。采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，分析载体肝干细胞WB—ES分泌表达的Endostatin对ECV304的增殖和凋亡的影响。结果载体肝干细胞胞外表达的Endostatin对人脐静脉内皮细胞ECV304生长有显著抑制作用，48h作用达到高峰，随浓度增加抑制作用增强；Endostatin作用的实验组，G1期细胞比例增加，s期细胞数下降，抑制细胞生长的机制可能主要是通过对细胞增殖的影响（P〈0．05）；实验组细胞存在细胞凋亡增加现象，但与对照组比较凋亡率差异无统计学意义。结论携带内皮抑素基因的载体肝干细胞WB-ES胞外表达的Endostatin在体外可有效抑制血管内皮细胞增殖，载体肝干细胞WB-ES有望成为靶向抗肿瘤血管生成的肝癌基因治疗载体细胞。     

瘤内局部注射重组人血管内皮抑制素对小鼠Lewis肺癌抑瘤作用的研究

目的探讨瘤内直接注射重组人血管内皮抑制素（恩度）联合腹腔注射顺铂对Lewis肺癌的抑制效果。方法成功建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型。按体质量将小鼠随机分为生理盐水组、顺铂组、瘤内注射恩度组、顺铂联合腹腔注射恩度组、顺铂联合瘤内注射恩度组5组。治疗后处死小鼠,计算肿瘤体积抑瘤率,用免疫组织化学法测定各组小鼠肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平及微血管密度（microvessel density,MVD）。结果顺铂组、瘤内注射恩度组、顺铂联合腹腔注射恩度组、顺铂联合瘤内注射恩度组的抑瘤率分别为61.8%、24.9%、70.3%、74.3%。免疫组织化学结果显示,顺铂联合瘤内注射恩度组的VEGF表达及MVD计数在各实验组中均最低,与顺铂联合腹腔注射恩度组比较两者差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论经皮穿刺瘤内注射恩度联合顺铂有协同抗肿瘤作用,能有效抑制肺癌的生长及转移,并且相同剂量的恩度,肿瘤内局部注射效果优于腹腔注射。     

血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和内皮抑素在肝硬化中的表达及意义

目的 探究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和内皮抑素（endostatin）在肝硬化中的表达情况。方法 收集从2015年1月至2016年6月河北医科大学第二医院肝胆外科收治的肝硬化患者22例,记为实验组;另选同期10例正常肝脏组织作为正常组。分别用HE和Masson三色染色观察两组标本;用免疫组织化学和酶联免疫吸附方法(ELISA)检测两组中VEGF,bFGF,Endostatin蛋白表达。结果 ①HE染色和Masson三色染色结果显示：与正常组相比,实验组镜下肝脏组织中纤维条索明显增多,有明显的假小叶生成,其间广泛分布炎性细胞,汇管区结构明显消失,肝细胞有不同程度地坏死,纤维增生也更加明显;②免疫组织化学：正常组VEGF,bFGF和Endostatin的蛋白相对灰度值分别为0.06±0.03,0.08±0.05和0.07±0.02;实验组VEGF,bFGF和Endostatin的相对灰度值分别为0.16±0.02,0.14±0.03和0.14±0.01;与正常组相比,实验组VEGF,bFGF和Endostatin表达明显上调,且差异均有统计学意义（P<0.05）。③ ELISA试验：正常组VEGF,bFGF和Endostatin的吸光度（OD值）分别为283.05±14.32,30.03±2.11和4 350.63±636.66;实验组VEGF,bFGF和Endostatin的OD值分别为539.63±160.28,63.99±33.28和8 194.75±1 319.28;与正常组相比,实验组VEGF,bFGF和Endostatin表达均明显上调,且差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 肝硬化患者VEGF,bFGF和Endostatin蛋白表达均明显上调,这些蛋白的表达与肝硬化发生发展密切相关。     

腺病毒CNHK200-hEndostatin质量控制方法的研究

目的:建立基因-病毒治疗系统CNHK200-hEndostatin的质量控制方法.方法:分别建立腺病毒蛋白鉴定、腺病毒基因组鉴定、人内皮抑素(hEndostatin)基因鉴定、人内皮抑素表达量检测、腺病毒颗粒数测定、腺病毒滴度和比滴度测定、纯度测定、野生型腺病毒(AdWT)检测、残余宿主DNA含量检测和牛血清蛋白残余量检测等腺病毒质量控制项目的方法,并对纯化的腺病毒样品进行初步检测.结果:建立用SDS-PAGE方法对腺病毒进行蛋白鉴定,用限制性内切酶图谱分析的方法对腺病毒进行基因组鉴定,用PCR方法鉴定人内皮抑素基因,用ELISA方法检测人内皮抑素表达量,用D260法和HPLC方法进行腺病毒颗粒数测定,用D260/D280方法和HPLC方法进行纯度检测,用PCR方法进行野生型腺病毒检测,用杂交方法进行残余宿主DNA含量检测,用反向间接血凝实验测定牛血清蛋白残余量.结果表明建立的方法可有效应用于腺病毒样品检测,并且我们制备的纯化腺病毒样品均符合要求.结论:基本建立了腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制方法,改良的应用HPLC对腺病毒颗粒数进行定量检测的方法准确迅速,优于传统方法.应用建立的方法对纯化的腺病毒样品进行检测,基本符合临床应用要求.