抗HBsAg dsFv和α-干扰素融合基因表达载体构建

目的构建抗HBsAg dsFv抗体在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达载体及抗HBsAg dsFv抗体与α-干扰素融合蛋白在CHO细胞表达载体。方法通过重叠延伸PCR方法成功地将VL基因与α-干扰素基因通过Linker连接,并利用分子生物学技术构建其在CHO细胞表达载体。结果获得靶向HBsAg的dsFv抗体与α-干扰素融合蛋白在CHO细胞表达系统。通过测序证明,基因工程抗体dsFv片段和α-干扰素在分子水平上重组,形成融合基因。结论成功构建抗HBsAg dsFv和α-干扰素融合基因,使表达的融合蛋白可能发挥双重作用,即抗体的导向作用和α-干扰素的抗病毒作用,不仅克服了单独使用α-干扰素治疗乙型肝炎的各种不足,而且还消除了人鼠单克隆抗体对人体产生过敏反应的危险,增强抗体在人体中的生物学效应。     

人源抗-HBsAg dsFv-IFN融合基因的构建及在CHO细胞中的表达

目的 :探讨用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 :在已有的抗HBsAg_dsFv的基础上 ,用重叠延伸PCR的方法将抗_HBsAg_dsFvVL 基因和α_干扰素基因连接 ,形成融合基因。为避免IFN与dsFv空间折叠的影响 ,其间引入 15个氨基酸的柔性短肽 ;分别构建重链VH 基因、轻链VL_IFN融合基因的CHO表达载体 ,共转染CHO细胞。结果 :从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在 ,有抗_HBsAg活性 ,但dsFv与抗原的结合活性较低。结论 :本研究为研制乙肝导向干扰素奠定了基础。     

抗肝癌hdsFv融合RC-RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定

目的制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析法纯化并复性,应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞,并且能够保持较强的稳定性。结论我们抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素的成功制备,为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。     

人源抗HBs靶向干扰素融合基因表达与鉴定

目的用抗体工程技术研制乙型肝炎人源抗HBs靶向干扰素。方法在已有的抗HBs dsFv的基础上,用重叠延伸PCR的方法将抗HBs dsFv VL基因和ɑ干扰素基因连接,形成融合基因。为避免干扰素（IFN）与dsFv空间折叠的影响,其间引入15个氨基酸的柔性短肽;分别构建重链VH基因、轻链VL-IFN融合基因的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达载体,转染CHO。结果从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在,活性单位为20000 U/ml;有抗HBsAg活性,D490为1.60,dsFv具有与抗原的结合活性。结论成功表达了既有抗HBs活性又有干扰素活性的融合蛋白,本研究为研制乙肝靶向干扰素奠定了基础。     

Bispecific digoxigenin-binding antibodies for targeted payload delivery

Bispecific antibodies that bind cell-surface targets as well as digoxigenin (Dig) were generated for targeted payload delivery. Targeting moieties are IgGs that bind the tumor antigens Her2, IGF1R, CD22, or LeY. A Dig-binding single-chain Fv was attached in disulfide-stabilized form to C termini of CH3 domains of targeting antibodies. Bispecific molecules were expressed in mammalian cells and purified in the same manner as unmodified IgGs. They are stable without aggregation propensity and retain binding specificity/affinity to cell-surface antigens and Dig. Digoxigeninylated payloads were generated that retain full functionality and can be complexed to bispecific antibodies in a defined 21 ratio. Payloads include small compounds (Dig-Cy5, Dig-Doxorubicin) and proteins (Dig-GFP). Complexed payloads are targeted by the bispecifics to cancer cells and because these complexes are stable in serum, they can be applied for targeted delivery. Because Dig bispecifics also effectively capture digoxigeninylated compounds under physiological conditions, separate administration of uncharged Dig bispecifics followed by application of Dig payload is sufficient to achieve antibody-mediated targeting in vitro and in vivo.     

抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)突变基因的构建与序列分析

ｄｓＦｖ是近年发展起来的一种新型基因工程抗体，具有分子小，稳定性好，生物学活性高等特点。我们采用ＰＣＲ定点突变方法，成功地构建了抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体的轻、重链突变基因，并进行了序列分析，证明在重链第４４位氨基酸和轻链第１００位氨基酸，已突变形成半胱氨酸（Ｃｙｓ），为进一步表达有活性的抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体奠定了基础。