日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导BIO细胞产生的研究

目的观察日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）与成虫抗原（SwAP）是否能够诱导小鼠调节性B细胞的产生。方法SEA、SWAP和脂多糖（LPS）分别体外刺激小鼠脾脏单个核细胞和磁珠分选后的脾脏CD19＋B细胞,72h后用流式细胞术分别检测CD19＋IL-10＋细胞比例,和细胞表面CD80、CD86及CD40的表达,用ELISA法检测培养上清中IL-10的水平。体内实验用SEA、SWAP、PBS分别和不完全弗氏佐剂混合免疫小鼠,1次／N,共3次,末次免疫后7d取小鼠脾脏,流式细胞术检测CD19＋IL-10＋细胞比例,用ELIsA法检测培养上清中IL-10的水平。结果LPS与SEA体外均能显著诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为CD19＋IL-10＋细胞,两者无显著差异,而swAP组不能诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为CD19＋II-10＋。细胞;SEA与LPS能够诱导脾脏CD19＋B细胞表面高表达CD80、CD86和CD40,而SwAP不能诱导脾脏CD19＋B细胞活化;SEA与LPS诱导脾脏CDt9＋B细胞分化为IL-10＋细胞的比例也显著升高,同时能刺激脾脏CD19＋B细胞分泌高水平的IL-10,两者无显著差异;而SwAP不能诱导小鼠脾脏CD19＋。B细胞分化为IL—10＋细胞并分泌IL-10。SEA体内免疫小鼠后,小鼠脾脏单个核细胞分化为CD19＋IL-10＋细胞比例显著升高,并且能够分泌高水平的IL-10,而swAP和PBS免疫组均不能诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为CD-9＋IL-10＋细胞并分泌1L-10。结论SEA体外体内均能诱导小鼠产生分泌IL-10的B10细胞,并且在体外不依赖于脾脏其他免疫细胞的参与,而SwAP体外体内均不能诱导B10细胞的产生。     

Vaccination of goats with 31 kDa and 32 kDa Schistosoma japonicum antigens by DNA priming and protein boosting

Two Schistosomajaponicum vaccine candidate antigens Sj 31 and Sj 32, which have shown particular promise to induce protective immunity in mice, were used to immunize goats by using a DNA priming-protein boosting strategy in present work. DNA vaccine formulations of the two antigens （VRSj31 and VRSj32） were produced and injected intramuscularly twice at a 2-week interval and then recombinant proteins （rSj31 and rSj32） together with Freund Complete Adjuvant （FCA） were used to boost the goats. The experiment was repeated in different batche cercariae. A strong anamnestic antibody response was induced after boost. A significant reduction of liver egg counts and miracidial hatching was showed in both experiments. Significant protections against challenge infection were elicited with 31.6% of percentage reduction for worm recovery in the second experiment and 20.9% in the first experiment, respectively.     

日本血吸虫T2核酸酶的原核表达及活性分析

目的 构建日本血吸虫T2核酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析。方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到与曼氏血吸虫虫卵抗原Omega-1同源性最高的蛋白AY814845,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区连入pET32a表达载体,转化大肠杆菌并用IPTG诱导其表达,最后对表达产物的核酸酶活性进行分析。结果 成功的构建了日本血吸虫T2核酸酶的表达载体,其编码区能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有一定的核酸酶活性。结论 从体外扩增了日本血吸虫T2核酸酶AY814845,明确其表达产物具有核酸酶活性,为今后深入研究该蛋白的功能打下了基础。     

日本血吸虫童虫期体被蛋白Th细胞表位预测及初步鉴定

目的预测并鉴定日本血吸虫童虫体被蛋白分子的Th细胞表位。方法利用在线服务器分别对有关序列进行跨膜区与信号肽的预测分析;采用结合基序扫描与计分矩阵等算法,以及基于多种分子动力学算法的配体受体相互对接的分子建模方法等进行Th细胞表位预测;人工合成肽采用以多聚赖氨酸为核心的含4个表位肽分支臂的复合抗原多肽;表位肽刺激免疫鼠脾淋巴细胞增殖效果的鉴定采用改良的MTT法。结果从373条日本血吸虫肝期童虫体被蛋白序列中筛得14条具有开放阅读框及信号肽结构的序列;预测得到至少与小鼠的1个MHCⅡ类分子结合的5个15肽表位序列;淋巴细胞增殖试验初步鉴定获得了1个SSLVISYSTVDRLVC（AY815893）候选体被蛋白Th细胞表位。结论初步鉴定了1个潜在的体被蛋白Th细胞表位,为进一步筛选抗血吸虫保护性Th细胞表位提供了理论和实验依据。     

日本血吸虫小蛋白型多药物/代谢物排出蛋白样基因(SMR-like)的发掘和生物信息学分析

目的日本血吸虫可能的多药物抗性基因的发掘和所编码的蛋白的结构、功能以及应用前景分析。方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPaSy,http：//ca.expasy.org/）和CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,以华支睾吸虫小蛋白多药物抗性基因（smr）为“饵”,从GenBank日本血吸虫基因数据库中发掘出其同源基因,预测蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景。结果从GenBank中找到了一个功能未知的日本血吸虫同源基因AY813157,氨基酸序列与华支睾吸虫smr蛋白的一致性达67%,相似性达80%;该基因含有一个完整的编码区,编码189个氨基酸;预测氨基酸序列具有主要协助因子超家族的结构特征,含有5段跨膜区,其中3段跨膜区中含有保守的精氨酸和组氨酸残基,有多个磷酸化位点和T、B细胞表位。拓扑学分析表明N端在胞内,C端在胞外,线性B细胞表位均位于胞外区。结论日本血吸虫AY813157基因可能编码一个小蛋白型多药物/代谢物排出蛋白,与阴离子型药物（如吡喹酮）的抗药性或有毒性的阴离子代谢物的排出有关;该蛋白可能定位于皮层的表膜,是一个日本血吸虫免疫诊断和疫苗的候选靶分子,在研究日本血吸虫的耐药机制及免疫诊断和疫苗方面较好的应用前景。     

pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB双价疫苗的构建及其免疫效果观察

目的构建日本血吸虫天然分子疫苗相关靶基因的双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB,并观察其免疫保护效果。方法分别以pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB为模板,设计引物扩增SjRPS4、SjCB,重叠PCR法将SjRPS4、SjCB拼接,扩增,经双酶切后与真核质粒载体pVAX1、pcDNA3.0连接,转化DH5α细胞,筛选阳性克隆;提取双价重组质粒、空质粒及pVAX1/SjRPS4,经左腿股四头肌注射昆明小鼠,14d后取肌肉组织切片进行间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色,证实双价重组质粒的表达;提取pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB及相应空载体,100μg/只或等量PBS经左腿股四头肌注射昆明小鼠,4周后以（20±1）条尾蚴贴腹感染,6周后检测减虫率、减卵率。结果PCR、EcoRI/XhoI双酶切及测序证实双价疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB构建成功;肌肉组织间接免疫荧光及酶免疫组织化学染色证实重组质粒能够在小鼠肌肉细胞内成功表达;与PBS组相比,pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4、pcDNA3.0/SjCB免疫小鼠各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）,各组与相应的空质粒组相比各指标差异亦具有统计学意义（P〈0.05）;两种不同载体构建的双价疫苗之间比较差异则无统计学意义（P〉0.05）。结论成功构建真核双价重组质粒pVAX1/SjRPS4·CB、pcDNA3.0/SjRPS4·CB,二者免疫昆明小鼠均可以产生比单价疫苗更好的免疫保护效果。     

日本血吸虫Sj14-3-3疫苗研究进展

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一类严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,研制疫苗防治该病是目前的研究热点.Sj14-3-3蛋白是一种有效的疫苗分子,该文就Sj14-3-3蛋白疫苗和核酸疫苗的研究进展进行综述.     

基于A1E3及BIC4单克隆抗体检测日本血吸虫循环抗原ELISA法的建立及现场初步应用

目的建立基于AlE3及B1C4单克隆抗体检测日本血吸虫循环抗原的夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）,并对其应用情况进行初步评价。方法采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot-ring）对A1E3及B1C4单克隆抗体进行特性分析,用ELISA法测定B1C4、A1E3单克隆抗体效价。采用棋盘格滴定法确定双单抗夹心ELISA法检测循环抗原的最佳工作浓度。在最佳条件下,分别检测20份急性血吸虫病病人血清、46份慢性m吸虫病病人血清及20份止常人血清,评价其检测敏感性和特异性。用建立的双单抗夹心ELISA法和市售检测血吸虫循环抗原的ELISA试剂盒检测湖北省江陵县IHA阳性血吸虫病病人血清72份,以评估双单抗夹心ELlSA法的检测效能。结果经SDS-PAGE和Westernblotting分析,纯化后的A1E3及B1C4在相对分子质量（M,）88000和52000处各有一条清晰重链,在吖．20000处有一条相同的轻链,且A1E3及B1c4可与可溶性虫卯抗原（SEA）及急性血口发虫病病人血清发牛特异性反应。BlC4单抗效价可达1：10^5,A1E3单抗效价可达1：30000。用B1C4、A1E3双单抗夹心ELISA法检测急、慢性血吸虫病病人粗清阳性率分别为100％和86．9％,检测20份正常人血清特异性为100％。双单抗夹心ELISA法及市售EIJJsA试剂盒检测日本血吸虫循环抗原阳性率分别为45．8％及43．1％。结论成功建立了基于A1E3及B1C4双单抗夹心ELISA法,该法检测日本m吸虫循环抗原具有较高的敏感性及特异性。     

退人退耕对人群血吸虫病流行性的影响

目的采用血清学方法检测人群血清中血吸虫抗体，探讨移民建镇造成的生态环境变化对人群血吸虫抗体水平的影响。方法选择退人又退耕的双退点、退人不退耕的单退点和未退人退耕的对照点各1个，2002—2005年连续采用斑点金免疫渗滤法（DIGFA）、EHSA两种血清学方法，纵向平行检测各试点人群血吸虫抗体。结果双退点DIGFA、EHSA检测人群血吸虫抗体阳性率分别从2002年的6．63％、7．26％下降到2005年的3．52％和3．71％，经卡方检验，差异均有统计学意义（x^2=5．2625，P〈0．05；x^2=6．3296,P〈0．05）；单退点和对照点人群的血吸虫抗体阳性率无显著变化。EHSA纵向检测3个试点人群血清血吸虫抗体的A450值，经单向方差分析，单退点2005年A450均值（0．147）较2003年（0．182）有了显著下降（P〈0．01）。双退点、对照点人群的血吸虫抗体A450均值无显著变化。结论移民建镇生态环境改变后人群血吸虫抗体水平呈动态下降趋势，生态环境改变对血吸虫病流行造成影响。     

日本血吸虫感染BALB／c小鼠脾脏细胞学的变化

目的观察BALB／c小鼠感染日本血吸虫（Schistosoma japonicum，$）6．8周后脾脏细胞学的改变情况。方法用日本血吸虫尾蚴腹贴法建立日本血吸虫感染的小鼠模型。6～8周后观察肝脏、脾脏大小．称重：做脾脏淋巴细胞计数；用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞的大小、密度和T、B细胞分类以及Th细胞亚群睛况：用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen，SEA）所诱导的特异性抗体IgG的产生情况。结果日本血吸虫感染BALB／c小鼠6～8周后，脾脏体积明显增大，重量增加，细胞数量明显增多。流式细胞仪检测发现脾脏中出现一群体积明显增大的细胞群，该群细胞表达少量的CD4、CD8、CD19和DX－5分子；Th1／Th2轴发生偏移，Th17细胞数量增多；ELISA结果表明血清中SEA特异性抗体IgG水平明显升高。结论日本血吸虫感染的BALB／c小鼠脾脏出现明显的细胞学改变，尤其是Th1细胞数目下降，浆细胞、Th2细胞及Th17细胞数目增多，为研究日本血吸虫感染后期虫卵肉芽肿形成的免疫病理机制奠定了基础。