pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

Control of recombination within and between DNA plasmids of Saccharomyces cerevisiae

Summary [2 m⁺ and [2m°] yeast were transformed to stable leucine prototrophy with the hybrid yeast — E. coli plasmid, pJDB219. This plasmid contains the entire sequence of the endogenous 2 m yeast DNA plasmid in addition to the yeast nuclear LEU2 ⁺ gene and the Co1E1 derivative, pMB9. In the [2 m⁺] transformants, a new wholly yeast LEU2 ⁺ plasmid, pYX, was generated, probably by a recombination event between pJDB219 and 2 m DNA. The plamid, pYX, in the absence of 2 m DNA, was found to exist in equimolar amounts of two forms, A and B, which probably arise by intramolecular recombination across the inverted repeat sequences of the 2 m DNA portion of the plasmid. pJDB219 was found to require the presence of 2 m DNA to undergo this intramolecular recombination. The results suggest that 2, m DNA and pYX code for a gene product required in this recombination event which pJDB219 cannot produce.     

Secretion of heterologous proteins by genetically engineered Streptococcus gordonii

The secretion of heterologous proteins by Streptococcus gordonii from genes present on plasmids or on the chromosome has been achieved with a novel recombination system. We have constructed an integration-mediated transformation system in oral streptococci to clone foreign DNA into either resident plasmids or the host chromosome. In this system, Escherichia coli plasmid pACYC184 was extensively modified and utilized to construct anchor, integration, and heterodimer plasmids for introduction of the foreign genes. In order to evaluate this system, we cloned the gene for cycloisomaltooligosaccharide glucanotransferase (CITase) isolated from Bacillus circulans T3040 into S. gordonii. A portion of the CITase gene devoid of its signal sequence was fused inframe to the signal sequence of the Streptococcus sobrinus gtfI gene. The CITase fused gene was then introduced into either a resident plasmid or the S. gordonii chromosome. The presence of the enzymatically active CITase in the culture fluids from plasmid-borne transformants was confirmed. These results indicate that the integration-mediated transformation system described is an effective means of engineering recombinant streptococci capable of secreting heterologous proteins.     

Detection of a novel “cryptic” plasmid of about 7.8 MDal in a non-penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae isolate from Munich

A novel plasmid of about 7.8 megadaltons (MDal) could be detected in a non-penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae strain isolated in Munich in 1987. As the strain showed no resistance against commonly used chemotherapeutic agents, at present the plasmid must be described as phenotypically cryptic.Corresponding author.     

鼠疫菌6 kb质粒核酸序列同源性比对分析

目的 分析云南省鼠疫菌6 kb(pYC)质粒核酸序列与GenBank中公开报道的多种细菌序列的同源性.方法 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST),对鼠疫菌pYC质粒全序列和开放式读码框架(ORFs)以及翻译蛋白进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对分析.结果 pYC质粒部分基因与宋内志贺菌质粒pKYM具有97.1%的同源性,与流感嗜血杆菌基因有92.1%的同源性,与伤寒沙门杆菌基因LT2和pIMVS1分别具有88.2%和87.2%的同源性,与大肠埃希菌0157:H7、K-12、ECOR31株局部基因分别具有81.4%、81.4%和84.7%的同源性.pYC质粒ORFs翻译蛋白ORF1与副鸡嗜血菌复制蛋白B具有47.2%的相似性,ORF4与大肠埃希菌推定蛋白具有52.7%的相似性,ORF5与假结核菌TriE蛋白具有48.3%的相似性,ORF6与大肠埃希菌PilxS/VirB5相似蛋白具有42.3%的相似性、与小肠结肠炎耶尔森菌TriD蛋白具有38.5%的相似性,ORFIO与伤寒沙门杆菌LT2细胞质蛋白具有83.1%的相似性.与大肠埃希菌0157:H7推定蛋白具有81.9%的相似性.ORF11与大肠埃希菌K12诱导损伤蛋白J具有81.4%的相似性.结论 pYC质粒DNA序列与肠杆菌科部分基因具有高度同源性,可能编码类似埃希菌属和耶尔森菌属推定蛋白、诱导损伤蛋白、TriD和TriE蛋白、Pilx5/VirB5相似蛋白.     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中质粒介导的喹喏酮类耐药研究

目的:研究国内11家医院分离大肠埃希菌(ECO)和肺炎克雷伯菌(KPN)中质粒介导的喹喏酮类耐药。方法:收集北京大学第三医院无重复临床分离产超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的ECO和KPN共84株,另10家医院相应菌株共155株,北京协和医院对头孢西丁不敏感的ECO和KPN共25株。采用琼脂稀释法测定抗生素最低抑菌浓度M IC;接合实验判断该基因位置和移动性;聚和酶链反应(PCR)及其产物测序确定基因型。结果:北医三院84株菌中1株KPN(编号24)阳性,ECO的发生率是0;余10家医院155株产ESBL s菌株中没有阳性结果;协和医院25个临床株中3株KPN(编号P 3、P 6、P 10)阳性。这4株菌只有P 6接合试验阳性,相应接合子qnr-PCR阳性。环丙沙星C IP对该菌的M IC是0.5μg/m l,对该接合子的M IC是1μg/m l,而对受体菌EC 600的M IC是0.125μg/m l。对24号标本和P 6标本及其接合子进行测序证实:二者的qnr↑序列和AY 878718(qnrA)100%同源,并且qnr基因的上游都有ORF 513存在。结论:北医三院和北京协和医院分类株中存在质粒介导的喹喏酮类耐药基因qnr,其他医院分离株本次研究中未发现该基因。     

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.     

小鼠DNA酶真核表达质粒在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 将构建好的小鼠DNA酶(DNaseI)真核表达质粒转染到小鼠骨髓间充质干细胞中,观察目的基因在细胞内的表达及分泌情况.方法 采用脂质体法将已构建好的小鼠DNaseI的真核表达质粒转染人小鼠骨髓间充质干细胞中,用Western blotting法检测DNaseI基因在骨髓间充质干细胞内的表达及DNA-甲基绿比色法检测培养上清液中DNaseI的活性.结果 小鼠DNaseI的真核表达质粒能够转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,转染效率约为30%.转染后的小鼠骨髓间充质干细胞可以表达DNaseI蛋白且分泌出具有活性的DNaseI.结论 脂质体法能够将小鼠DNaseI的真核表达质粒转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,小鼠DNaseI基因在小鼠骨髓间充质干细胞中成功表达并分泌具有生物活性的DNaseI.     

细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶基因克隆、序列分析及功能的初步鉴定

目的 从新疆株细粒棘球蚴中克隆细胞外信号调节激酶(EgERK1)基因,进行序列测定、生物信息学分析,蛋白表达及功能初步鉴定.方法 设计特异性引物,从新疆株细粒棘球蚴中提取总RNA,RT-PCR法扩增EgERK1基因,构建pET28a-EgERK1原核表达质粒,测序确定序列并进行生物信息学分析.构建正确的pET28a-EgERK1原核表达质粒,经诱导、表达EgERK1重组蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹检测其生物学功能.结果 RT-PCR扩增出的条带经测序,结果显示其长度为1125 bp,编码374个氨基酸,等电点为6.34,BLAST比对结果提示为一薪基因,命名为EgERK1(EU701008).同源性比较表明,EgERK1与多房棘球绦虫ERK基因(EmMPK1)同源性为95.45%,与线虫、酵母、果蝇和人类等ERK基因的同源性为43.04%～61.88%.进化树分析发现EgERK1和EmMPK1相聚集.功能分析预测EgERK1具有ERK类激酶T-X-Y结构保守区和酶激活功能域.Western印迹显示,原核诱导表达的EgERK1重组蛋白能与抗人ERK1/2抗体发生特异性免疫反应.结论 成功克隆细粒棘球蚴EgERK1新基因,发现EgERK1重组蛋白具有与ERK1/2抗体结合的功能,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础.