Ac-SDKP经HSP27调节锌指蛋白而抑制肺上皮细胞-间质转化

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是否通过抑制热休克蛋白27(heat-shock protein 27,HSP 27)的表达,进而抑制锌指蛋白SNAI1、SNAI2的表达,而发挥阻抑转化生长因子(TGF)-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞(肌成纤维细胞)的转化以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:激光共聚焦检测TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞转化中HSP27及SNAI1、SNAI2蛋白的共定位表达;real-time PCR法检测HSP27、SNAI1和SNAI2 mRNA的表达;Western blotting法检测HSP27、SNAI1、SNAI2和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,以及转染HSP27干扰质粒后SNAI1、SNAI2蛋白及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,TGF-β1刺激组HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达增强;给予Ac-SDKP干预后,HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达明显降低,差异有统计学意义。用HSP27的干扰质粒转扰细胞后,SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达降低,其中SNAI1和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达与TGF-β1刺激组比较差异有统计学意义。这与Ac-SDKP干预的结果相似。结论:Ac-SDKP能够通过对HSP27表达的调节,降低锌指蛋白SNAI1和SNAI2的表达,进而抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化及胶原蛋白的合成。     

AcSDKP对大鼠心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性和MMP-1表达的影响

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对10%血清和血小板源性生长因子(PDGF)诱导的大鼠心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性和MMP-1表达的调节作用。方法明胶酶谱法检测心成纤维细胞MMP-2、MMP-9的活性。Western blot法检测心成纤维细胞MMP-1的表达。结果10%血清和PDGF使心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性增强,也促进MMP-1的表达;AcSDKP能够进一步增加由10%血清和PDGF诱导的心成纤维细胞MMP-2、MMP-9的活性,并促进MMP-1的表达。结论AcSDKP上调了由PDGF介导的心成纤维细胞MMPs活性或表达,这可能与AcSDKP抗心肌纤维化的作用相关。     

Ac-SDKP与AngⅡ信号交互作用对矽肺纤维化发生、发展的影响

目的 观察N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)和血管紧张素转换酶(ACE)/血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)轴在大鼠矽肺纤维化发生、发展过程中的表达变化及其对矽肺纤维化形成的影响.方法 60只雄性Wistar大鼠随机分为6组(n=10),分别染尘0、2、4、8、12、16周构建大鼠矽肺模型.HE染色观察肺组织形态,Western blotting检测矽肺大鼠肺组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤连蛋白(Fn)、ACE及AT1R蛋白的表达,ELISA法检测矽肺大鼠肺组织中Ac-SDKP和AngⅡ的含量.结果 HE染色结果显示,大鼠染尘2周后即可见肺泡壁增宽及巨噬细胞浸润,4周组偶见孤立的细胞性结节形成(主要由巨噬细胞构成),8周组和12周组大鼠肺泡间隔增宽明显,且细胞性结节数量增多,16周组肺组织内可见多个细胞性结节的融合和间质纤维化的形成,并可见细胞纤维性矽结节的形成.与对照组比较,矽肺模型4、8、12、16周组大鼠肺组织α-SMA、Col Ⅰ、Fn蛋白表达逐渐增高(P＜0.05),2、4、8、12、16周组大鼠肺组织ACE、AngⅡ、AT1R蛋白表达逐渐增高(p＜0.05),而大鼠肺组织中Ac-SDKP的表达水平在矽肺模型2周组明显高于对照组(P＜0.05),随后逐渐降低,在12周和16周组已明显低于对照组(P＜0.05).结论 矽肺局部组织ACE/AngⅡ/AT1R的表达在矽肺发生、发展过程中逐渐升高,而Ac-SDKP的表达逐渐降低.Ac-SDKP和AngⅡ信号参与了大鼠矽肺纤维化的过程.     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对血清诱导的心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性表达的调节作用

①目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对不同浓度血清（FBS）诱导的大鼠心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9酶活性表达的调节作用。②方法选用新生大鼠心脏成纤维细胞；采用明胶酶谱法检测心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9酶活性的表达。③结果在0．4％、2％和10％几种血清浓度的条件下，随着血清浓度的增加，MMP-2、MMP-9酶活性表达增强。AcS-DKP能够进一步增加由10％血清诱导的心脏成纤雏细胞MMP-2、MMP-9酶活性的表达。④结论AcSDKP上调了由血清介导的心成纤维细胞MMP-2，MMP-9酶活性表达，这可能与AcSDKP抗心脏纤维化的作用相关。     

N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1的调节在大鼠矽肺纤维化形成中的作用

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对大鼠肺内基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的调节在拮抗矽肺纤维化形成过程中的作用.方法:气管内灌注染尘法制作大鼠矽肺模型,将含有AcSDKP的微量药物释放泵埋入腹腔.实验动物随机分为矽肺模型对照4周组,矽肺模型对照8周组,矽肺模型4周组,矽肺模型8周组,抗纤维化治疗组及预防治疗组.H-E染色和免疫组织化学显色对矽肺纤维化病变和MMP-1和TIMP-1在肺组织内的表达进行形态学观察;免疫印迹法对肺内MMP-1和TIMP-1酶蛋白表达进行检测.结果:与模型对照组比较,矽肺大鼠肺内MMP-1和TIMP-1表达增强.与矽肺模型组比较,AcSDKP能够上调矽肺大鼠肺内MMP-1的表达,下调TIMP-1的表达,使MMP-1/TIMP-1的比值升高.结论:AcSDKP能够促进矽肺大鼠肺内MMP-1的表达,抑制TIMP-1的表达,从而加速了细胞外基质(包括胶原)的降解,这可能与AcSDKP抗矽肺纤维化的作用有关.     

AcSDKP对硅肺纤维化大鼠胶原含量及NF-κBp65表达的影响

目的研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对硅肺纤维化大鼠肺内胶原合成及核转录因子κB(NF-κB)p65的影响。方法将大鼠分为3组:对照组(每只大鼠支气管内灌注生理盐水1mL,8周后处死)、硅肺模型组(每只大鼠支气管内灌注SiO2混悬液1mL,8周后处死)、AcSDKP治疗组(每只大鼠支气管内灌注SiO2混悬液1mL,并持续给予AcSDKP 800μg·kg-1·d-1,8周后处死)。从HE染色、VG染色和羟脯氨酸胶原测定法检测各组大鼠肺纤维化程度及胶原含量,用免疫组化法和免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白的表达。结果与对照组比较,硅肺模型组硅结节的数量、胶原含量和NF-κB p65的表达增高。与硅肺模型组相比,AcSDKP治疗组矽结节的数量、胶原含量和NF-κB p65的表达降低。结论 AcSDKP可能会通过增加B抑制蛋白(I-κB)的稳定性来抑制NF-κB p65的活性及表达,进而影响着肺泡炎与硅肺纤维化的进展。     

AcSDKP对TGF-β 1诱导的大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成及表达的调节作用

目的 探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心脏成纤维细胞胶原合成的调节作用.方法 差速贴壁法获取大鼠心脏成纤维细胞;采用3H-脯氨酸掺入法检测心脏成纤维细胞胶原蛋白的合成.采用免疫细胞化学染色和Western blotting法检测心脏成纤维细胞Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果 随着TGF-β1浓度的增加(1μg/L, 2.5μg/L,5μg/L,7.5μg/L),细胞脯氨酸含量(CPM值)逐渐增加(分别为147.6±10.2,229.2±16.4,427.0±40.6,454.8±26.1),分别是对照组(CPM值为91.6±9.8)的1.61倍、2.50倍、4.66倍、4.97倍,差异均有显著性(P<0.05).当加入不同浓度的AcSDKP(10-10mol/L,5×10-10mol/L, 10-9mol/L, 10-8mol/L)时,细胞脯氨酸含量逐渐下降(CPM值为378.8±6.4,292.8±14.4,130.6±17.6,230.6±19.4),分别是TGF-β1组(5μg/L)的88.7%,68.6%,30.6%,54.0%.差异均具有显著性(P<0.05).免疫细胞化学结果显示,TGF-β1组(5μg/L)细胞内Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白平均吸度值分别是对照组的1.36倍和2.12倍,差异具有显著性(P<0.05); Western blotting法结果显示,TGF-β1组的Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白表达条带吸光度值分别是对照组的1.09倍和1.29倍,差异具有显著性(P<0.05).当给予AcSDKP(10-9mol/L)进行干预时,免疫细胞化学结果显示,细胞内Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白表达强度较TGF-β1组减弱,其平均吸光度值分别是TGF-β1组的61.3%和68.5%,差异具有显著性(P<0.05).Western blotting法结果显示,Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白表达条带吸光度值分别是TGF-β1组的83%和54%,差异具有显著性(P<0.05).结论 AcSDKP对TGF-β1介导的心脏成纤维细胞胶原合成与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达有明显抑制作用,这可能与其抗心脏纤维化的作用相关.     

AcSDKP体外抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能研究*

目的 探讨N-乙酰-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能的影响。方法 取小鼠RAW264.7巨噬细胞体外培养,分为对照组、脂多糖（LPS）组和LPS加不同浓度的AcSDKP（1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L）处理组。采用荧光定量PCR法检测细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞素（IL）-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）mRNA相对水平;使用Transwell小室检测RAW264.7细胞的趋化能力;采用Western blot法检测细胞iNOS、磷酸化的蛋白激酶复合体抑制物(p-IKK)、磷酸化的κB抑制蛋白(p-IκB)和磷酸化的P65（p-P65）蛋白表达水平。结果 LPS处理组TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著高于对照组【分别高出（41±2.1）倍、（1073±80.8）倍和（1726±110.2）倍,P<0.01】;AcSDKP（10 nmol/L和100 nmol/L）处理组TNF-α水平显著低于LPS处理组【分别降低19.0% 和39.3%,P<0.01】;AcSDKP（1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L）处理组IL-1β水平显著低于LPS处理组【分别降低22.08%、35.8%和38.2%,P<0.01】;AcSDKP（1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L）处理组IL-6水平显著低于LPS处理组【分别降低15.8%、35.7%和43.3%,P<0.01】;LPS处理组穿过小室的细胞数为（136±5.3）个/HP,显著高于对照组【（64±5.3）个/HP,P<0.01】,而AcSDKP处理组穿过小室的细胞数【分别为（105±4.8）、（85.3±5.0）和（73.7±5.6）个/HP】,显著低于LPS组【（136±5.3）个/HP,P<0.05】;LPS处理组iNOS mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组【分别为（21±2.5）倍和（5.9±0.4）倍,P<0.01】,而AcSDKP处理组iNOS mRNA显著低于LPS处理组【分别降低37.8%、23.3%和33.1%,P<0.05】;在10 nmol/L和100 nmol/L浓度AcSDKP处理组,两种蛋白水平显著低于LPS处理组【分别降低27.0%和40.2%,P<0.05】;LPS处理组p-IKK、p-IκB和p-P65表达量均显著高于对照组【分别为（25.9±4.8）倍、（9.5±0.6）倍和（2.1±0.2）倍,P<0.01】,而AcSDKP（10 nmol/L）处理组三者水平较LPS处理组显著下降【分别为42.5%、17.8%和29.7%,P<0.05】。结论 AcSDKP可抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,这一效应可能与阻断IKK/ IκB/NF-κB通路有关。     

Ac-SDKP对实验性矽肺纤维化模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞衰老信号激活的调节作用

目的 观察N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)对实验性矽肺纤维化进程中肺泡II型上皮细胞细胞衰老的作用及其机制.方法 SPF级Wistar大鼠分组为对照组、矽肺模型组和Ac-SDKP治疗组.肺泡II型上皮MLE-12细胞分组为空白对照组、SiO2组、Ac-SDKP组和SiO2+Ac-SDKP组...     

Ac-SDKP 通过调节HDAC6 和HSP90抑制矽肺纤维化的机制研究

目的 探讨Ac-SDKP 通过对组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）、热休克蛋白90（HSP90）的调节，抑制大鼠矽肺纤维化的作用机制。方法 非暴露式支气管内灌注法复制大鼠矽肺模型，分为对照4 周组、矽肺模型4 周组、对照8 周组、矽肺模型8 周组、Ac-SDKP 抗纤维化治疗组和Ac-SDKP 预防治疗组。采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导原代培养新生大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并予以Ac-SDKP 和HDAC6 特异性抑制剂TCS HDAC6 20b 预处理。采用苏木精- 伊红染色法观察病理形态变化，免疫组织化学法、Western blot 检测Ⅰ型胶原、α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、HDAC6 及HSP90 的表达。结果 免疫组织化学法结果显示，HDAC6 和HSP90 阳性表达主要位于矽结节内，给予Ac-SDKP 抗纤维化治疗或预防治疗均能抑制Ⅰ型胶原、α-SMA、HDAC6 及HSP90 蛋白表达的上调。而TGF-β1 能诱导大鼠成纤维细胞α-SMA 阳性表达，同时伴随HDAC6 和HSP90 蛋白表达上调，而予以TCS HDAC6 20b 或Ac- SDKP 预处理均能抑制该变化。结论 Ac-SDKP 能够通过对HDAC6 和HSP90 信号的调节，在体内外抑制矽肺大鼠肌成纤维细胞分化和胶原沉积，从而发挥抗矽肺纤维化的作用。