赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析

目的：对问号赖型钩端螺旋体（赖型钩体）DNA疫苗[包括内鞭毛蛋白基因（flaB2)和质粒DNA表达载体（VR1012）]的CpG基序（CpG motifs)进行分析，为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础。方法：以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原，对flaB2及VR1012全核苷酸序列进行计算机分析（分类、计数和定位）。结果：CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤，“G”的侧翼为两个嘧啶，在flaB2中共3个，分别为GACGCT，GACGTC和GACGCC；在VR1012中共11个，分别为GACGTC1个，GACGCT2个，GACGCC1个，GACGTT1个，GGCGTT2个，GGCGCT2个，GGCGCC1个，AACGCT1个，其中特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个，位于5'端456－463；509－516；592－599；778－785和486－493；4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5'端且相对集中。结论：赖型钩体flaB2与VR1012构成的DNA疫苗含有TGACGTCA等CpG，这些基序又称免疫刺激序列，构成了DNA疫苗中的佐剂。     

钩端螺旋体核糖体提取物免疫保护作用的研究

作者对核糖体现有的制备方法进行了部分改进,从黄疸出血群赖型017株钩体中成功地制备了核糖体提取物。该提取物经SPA-ELISA 证实具有免疫原性,对40只受试豚鼠的保护试验结果表明,核糖体提取物对同型毒株的攻击具有明显的保护作用;结果还证明核糖体提取物能诱导机体的体液免疫反应。     

钩体基因疫苗对豚鼠延髓原癌基因表达的影响

我们的研究已表明，赖型０１７株钩体外膜疏水蛋白ＯｍｐＬ３９是稳定的免疫原，在此我们分别用ＯｍｐＬ３９与钩体死菌苗和生理盐水对照免疫豚鼠，研究ＯｍｐＬ３９的免疫保护作用和免疫机理，对ＯｍｐＬ３９的抗原特异性刺激引起中枢原癌基因（Ｃｆｏｓ基因）表达进行了观察。结果表明，ＯｍｐＬ３９在豚鼠体内能产生高效价的阳性抗体，免疫保护率为１００％。在ＯｍｐＬ３９对中枢Ｃｆｏｓ基因表达的影响中，我们观察到ＯｍｐＬ３９免疫的豚鼠较空白和死菌苗组Ｃｆｏｓ表达明显少于死菌苗组和空白对照组（ｐ＜００５）。提示ＯｍｐＬ３９能特异性地抑制Ｃｆｏｓ基因的表达，减轻强毒钩体对动物体内的病理损伤，有较死菌苗强的免疫保护作用。     

赖型钩端螺旋体重组DNApCX7的特异性鉴定和限制性内切酶谱分析

本实验将赖型钩端螺旋体（简称钩体）ＤＮＡ基因库的克隆ｐＣＸ７制备成￣（３２）Ｐ－重组ＤＮＡ探针，对８个不同血清群的１７株问号状钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃⅠ株以及细螺旋体３０５５株ＤＮＡ进行打点杂交；同时用１５种ＤＮＡ片断进行限制性内切酶谱分析。结果表明，该重组ＤＮＡ具有问号状钩体种（Ｓｐｅｃｉｅｓ）特异性，但与不同问号状钩体之间的同源性程度有差别；限制性内切酶谱分析发现ｐＣＸ７重组ＤＮＡ片段长约１．７ｋｂ，具有１个Ｂｇ１Ⅱ识别位点和３个ＢｓｔＢ１识别位点。     

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.     

双曲钩端螺旋体溶血素基因tlyA的克隆、表达及初步功能鉴定

目的研究双曲钩端螺旋体(简称双曲钩体)是否含有溶血素基因,并鉴定其溶血活性。方法对双曲钩体LEBIa2503基因编码产物进行结构域预测、序列比对后,PCR扩增目的片断,克隆到原核表达载体pET28b( ),转化宿主细胞,并诱导表达产物进行初步功能鉴定。同时,以RT-PCR检测LEBIa2503的转录情况。另外,也对双曲钩体菌体本身有无溶血活性进行检测。结果双曲钩体LEBIa2503基因与问号钩体tlyA溶血素基因在蛋白水平上有相同的结构域,属于直系同源基因(orthologues gene)。原核表达的重组融合蛋白在羊血平板上出现β-溶血环。以RT-PCR的方法能检测到在双曲钩体中有LEBIa2503基因的转录,但双曲钩体菌体本身则检测不到溶血活性。结论未发现双曲钩体有溶血活性,但其含有溶血素基因tlyA,并且在普通培养环境下能被转录,这对进一步研究其内在机制奠定了基础,并对探索致病性问号钩体致病机制提供了一定线索。     

Interaction of spirochetes with the host fibrinolytic system and potential roles in pathogenesis

Abstract

The pathogenic spirochetes Borrelia burgdorferi, B. hermsii, B. recurrentis, Treponema denticola and Leptospira spp. are the etiologic agents of Lyme disease, relapsing fever, periodontitis and leptospirosis, respectively. Lyme borreliosis is a multi-systemic disorder and the most prevalent tick-borne disease in the northern hemisphere. Tick-borne relapsing fever is persistent in endemic areas worldwide, representing a significant burden in some African regions. Periodontal disease, a chronic inflammatory disorder that often leads to tooth loss, is caused by several potential pathogens found in the oral cavity including T. denticola. Leptospirosis is considered the most widespread zoonosis, and the predominant human disease in tropical, undeveloped regions. What these diseases have in common is that they are a significant burden to healthcare costs in the absence of prophylactic measures. This review addresses the interaction of these spirochetes with the fibrinolytic system, plasminogen (Plg) binding to the surface of bacteria and the generation of plasmin (Pla) on their surface. The consequences on host–pathogen interactions when the spirochetes are endowed with this proteolytic activity are discussed on the basis of the results reported in the literature. Spirochetes equipped with Pla activity have been shown to degrade extracellular matrix (ECM) components, in addition to digesting fibrin, facilitating bacterial invasion and dissemination. Pla generation triggers the induction of matrix metalloproteases (MMPs) in a cascade of events that enhances the proteolytic capacity of the spirochetes. These activities in concert with the interference exerted by the Plg/Pla on the complement system – helping the bacteria to evade the immune system – should illuminate our understanding of the mechanisms involved in host infection.     

钩端螺旋体脂多糖对小鼠感染伤寒沙门氏菌O_(901)的保护作用

钩端螺旋体(钩体)属革兰氏阴性菌,可是有无内毒素尚无定论。笔者曾发现,从黄疸出血群软型钩体提取的脂多糖,在化学结构上与大肠杆菌内毒素相似,并显示出革兰氏阴性菌内毒素的生物学活性,但它能否象革兰氏阴性杆菌那样提高机体非特异性抗感染力尚不清楚。本试验结果证实,它和大肠杆菌内毒素一样,能够显著提高小鼠感染伤寒沙门氏菌后的存活率,即提高机体的非特异性抗感染力。试验结果还表明,钩体脂多糖的提高机体非特异性抗感染作用受其剂量的影响,它的作用机制尚需进一步研究。     

致病性钩端螺旋体限制性内切酶酶切分析分型研究

为了建立一种简便、稳定的钩体分型方法,我们采用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ对致病性钩端螺旋体八个血清群５４个血清型６４株国内外钩体参考株及２７株野生株进行限制性内切酶酶切分析（ＲＥＡ）。结果表明：９１株菌中共有５９种不同的限制性内切酶图谱（ＲＥＰｓ）,根据前５条高分子酶切片段可以区分不同的ＲＥＰｓ;除部分血清群中个别不同的血清型有相同的ＲＥＰ型外,大部份血清型都有其独特的ＲＥＰ型,同一血清群往往拥有共同的酶切片段;所研究的同一血清型的国内和国际参考株的ＲＥＰｓ不同;大多数野生株的ＲＥＡ型和参考株相同,差异仅表现为个别高分子带的缺少和增加,ＲＥＡ分型和血清分型吻合较好,通过ＲＥＡ分型基本可区分不同的血清型。     

中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫

目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。