腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头瘤病毒18型E6E7基因构建及其转化作用的鉴定

目的：探讨人乳头瘤病毒（HPV）的E6E7基因在细胞恶性转化中所起的作用。方法：将人乳头瘤病毒（HPV）的E6E7基因克隆至腺病毒伴随病毒表达载体中，通过包装的重组病毒感染，将E6E7基因导入并整合到永生293细胞的基因组中。结果：本研究成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒并感染了永生293细胞，PCR／Southern杂交分析表明E6E7基因在转化细胞293TL中确有表达，转化细胞293TC和293TL具有明显的转化表型，和亲本293细胞相比，生长速度快，接触抑制消失，集落形成率提高20倍，且集落明显增大，形成时间短。结论：成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒，HPV18 E6E7基因引起永生化人上皮细胞293的恶性转化。此病毒可用于感染正常上皮细胞，研究其致癌机制。     

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的 运用噬菌体表面表达技术，获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞。提取总RNA，逆转录cDNA，聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段，并在E.coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体，并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上。转染昆虫sf-9细胞，利用杆状病毒，昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs-31，腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光试验呈阳性，序列分析结果表明是一新的序列，所获得的基因为人源IgG Fab基因。由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性，免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒，不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段，并在真核系统中表达了其全抗体，它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位。     

新型Tet-On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

目的　通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害。方法　首先在pAAV- GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA_2s S_2和四环素反应元件 (TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV- rtTA_2s -S_2- TRE -GDNFflag。与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ- PCR)检测病毒效价。rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA_2s S_2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控。结果　体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在 2周内表达 (32 .6pg/ml±2 .6pg/ml),高于强力霉素阴性组 ( 10 .1pg/ml±2 .4pg/ml),差异有统计学意义。结论　Tet -On反式激活因子rtTA_2s S_2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s -S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达。     

质粒辅助重组腺病毒相关病毒的制备和纯化

目的　探讨制备、纯化 2型重组腺病毒相关病毒 (rAAV2 )载体的简便、高效的方法。方法　采用磷酸钙方法将质粒辅助腺病毒相关病毒重组系统转染HEK2 93T细胞 ,重组rAAV ,通过氯仿 PEG80 0 0 /NaCl 氯仿法结合超滤纯化rAAV病毒。采用蛋白电泳和Western印迹检测病毒外壳蛋白 ,斑点杂交和病毒转染检测病毒的物理和感染滴度。结果　rAAV物理滴度为 2× 10 13 /ml,感染滴度为 5× 10 11/ml。结论　本实验方法简便、高效 ,不需要特殊的仪器设备 ,在普通实验室均可完成 ,制备的病毒纯度和滴度均可以满足动物实验需要。     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.     

血管内皮生长因子反义核苷酸抑制大鼠角膜新生血管的实验研究

目的探讨重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子反义核苷酸(rAAV aVEGF165)抑制大鼠角膜新生血管(CNV)发生与发展的作用。方法三质粒共转染法构建rAAV aVEGF165和重组腺相关病毒介导的β半乳糖苷酶的结构基因(rAAV Lacz)。48只SD大鼠用抽签法随机分成实验组和对照组,每组24只,碱烧伤方法诱导CNV生成。实验组结膜囊注射rAAV aVEGF165(1010pfu/ml),对照组结膜囊注射rAAV Lacz(1010pfu/ml);5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(X gal)组织化学染色,检测Lacz基因在结膜囊中的表达情况;碱烧伤后1、2、4、7、14及30d,形态学分析评价角膜新生血管的生长情况,免疫组织化学检测角膜组织中VEGF的表达。结果对照组rAAV Lacz结膜囊注射2d后,检测Lacz基因在结膜组织中的表达效率为21.36%±1.07%;30d后Lacz基因在结膜下组织中的表达效率为28.02%±1.16%。碱烧伤后结膜囊注射rAAV aVEGF165,实验组CNV面积明显减少,新生血管密度降低,VEGF在角膜组织中的表达明显降低,差异有统计学意义(F=1639.22,F=2187.16,F=719.17,P<0.01)。结论rAAV aVEGF165能显著抑制碱烧伤后CNV的形成,其机制与降低角膜组织中VEGF的表达有关,重组腺相关病毒是眼反义基因治疗的有效载体。     

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。     

重组AAV2-色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的 体外培养人视网膜微血管内皮细胞,探讨重组rAAV2-色素上皮衍生因子(PEDF)对该细胞在不同氧环境下增殖的影响.方法 实验研究.2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得视网膜微血管内皮细胞;接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO237 ℃培养箱内培养.相差显微镜观察细胞形态及生长情况.抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞.以125 μmol/L CoCl2建立HRCECs化学低氧模型,观察低氧对内皮细胞增殖的影响.按照105病毒基因组数/细胞的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测PEDF蛋白表达.MTT法测定rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞增殖的影响.流式细胞仪检测rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞凋亡的影响.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析.结果 原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48～72 h贴壁,2周左右细胞融合.第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞呈阳性.转染病毒48 h后,激光共焦显微镜下观察可见EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测,实验组PEDF表达明显强于其他组.MTT结果显示,单纯低氧处理,正常对照组A值为0.085±0.021,实验组A值为0.166±0.024(t=3.938,P＜0.05).rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为:正常对照组0.171±0.011,rAAV2-EGFP组0.178±0.016,rAAV2-PEDF组0.169±0.017(F=0.01,P＞0.05).rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为:单纯CoCl2组0.166±0.013,CoCl2+rAAV2-EGFP组0.155±0.012,CoCl2+rAAV2-PEDF组0.116±0.015(F=6.25,3.50;P＜0.05).rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.3%,rAAV2-EGFP组为3.3%,rAAV2-PEDF组为1.7%.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl2组凋亡细胞比例为3.6%,CoCl2+rAAV2-EGFP组为6.7%,CoCl2+rAAV2-PEDF组为36.4%.结论 rAAV2-PEDF转染人视网膜微血管内皮细胞后PEDF可稳定表达,并能显著抑制低氧诱导下内皮细胞的增殖.

Abstract：

Objective To culture human retinal capillary endothelium cells(HRCECs) in vitro and explore the effect of rAAV2-PEDF on proliferation of HRCEs. Methods Retinas were digested by 2. 5%trypsin and 0.1% collagenase Ⅰ in order. The isolated cells were cultured on fibronectin-coated dishes in media of human endothelial-sFM basal growth medium (HE-SFM BGM) with 10% fetal bovine serum,insulin-transferin-selenium (ITS) and endothelial cell growth factor (ECGF). The cultured cells were identified by anti-factor Ⅷ related antigen though immunohistochemistry stain. The effect of hypoxia induced by CoCl2 on proliferation of HRCECs was assessed by MTT assay. After rAAV2-PEDF were transfected into HRCECs, the EGPF positive cells were observed by laser confocal scanning microscop, the protein expression of PEDF were detected by Western blot, and the proliferation of HRCECs were checked by MTT assay. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis of HRCECs. Results Cultured HRCECs attached in the bottom of dishes in 48 h-72 h and grew to confluence in 2 weeks after seeding. HRCECs were with a positive brown staining for factor Ⅷ. EGPF positive cells were seen under laser confocal scanning microscop after 48h of rAAV2-EGFP transfection. The expression level of PEDF protein was higher in experimental group than in control group. The results of MTT assay showed the numeric value OA was 0.085±0.021 in normal group and 0.166±0.024 in hypoxia group(t =3.938,P＜0.05). In normal oxygen condition, the numeric value OA was 0.171±0.011 in normal control group, 0.178±0.016 in rAAV2-EGFP treated group, and O. 169±0.017 in rAAV2-PEDF treated group(F=0.01 ,P＞0.05). In hypoxia condition, the numeric value OA was 0.166±0.013 in CoCl2 treated group, 0.155±0.012 in CoCl2 + rAAV2-EGFP treated group, and 0.116±0.015 in CoCl2 + rAAV2-PEDF treated group. In normal oxygen condition, the ratio of apoptosis was 2. 3% in normal contral group,and 3. 3% in rAAV2-EGFP treated group,and 1.7% in rAAV2-PEDF treated group. In hypoxia condition, the ratio of apoptosis was 3.6% in CoCl2 treated group,6.7% in CoCl2 + rAAV2-EGFP treated group, and 36. 4% in CoCl2 + rAAV2-PEDF treated group.Conclusions PEDF gene can stably express in HRCECs after rAAV2-PEDF transfection and can obviously inhibit proliferation of HRCECs in hypoxia.     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用。方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用。结果rAAVSMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复。结论rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法。     

帕金森病大鼠三重目的基因共表达的长期行为改善

目的　探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病基因治疗的效果。方法　分别构建编码酪氨酸羟化酶 (TH)、芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)和三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)基因的腺伴随病毒 (AAV)载体 ,用复合感染的方式将AAV TH、AAV AADC及AAV GCH通过立体定向法注射入帕金森病大鼠损毁侧纹状体。采用免疫组化方法确定TH、AADC和GCH的表达 ;并连续观测基因转导后大鼠行为改善的情况长达 1年。结果　组织学依据显示TH、AADC和GCH基因均可在纹状体内长期有效而稳定的进行表达 ;三重基因转导可引起大鼠较TH和AADC共转导更为显著的行为改善(P <0 0 1)。结论　AAV载体介导的TH、AADC和GCH三重基因纹状体内共表达对于帕金森病大鼠的基因治疗更为有效。