组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。     

短期冻存对大鼠骨髓基质干细胞的影响

目的 探讨不同冻存条件对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）复苏后存活、增殖及向肝细胞分化能力的影响。方法比较用含不同浓度血清的冻存液冻存不同时间的BMSC8复苏后的存活率与贴壁率、增殖、向肝细胞分化能力。结果用血清浓度为90％的冻存液经不同时间冻存后的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率最高，且其增殖及向肝细胞分化能力与正常对照组相比差异无统计学意义；而血清浓度为50％及20％时BMSCS复苏后的存活率、贴壁率较低，增殖及向肝细胞分化能力下降，与正常对照组相比差异有统计学意义。结论高浓度血清冻存液短期冻存对BMSCs的存活、增殖、分化能力影响较小，细胞复苏后可用于进一步研究。     

海藻糖对低温储存皮肤组织桥粒芯糖蛋白2表达及皮肤活力影响的实验研究

目的：比较海藻糖与传统低温保护剂丙二醇对皮肤低温保存后桥粒芯糖蛋白2（Dsg2）表达以及皮肤活力的影响,为寻求皮肤组织低温保护剂的优良配方提供实验依据。方法：经患者同意在烧伤后整形术中获取患者新鲜皮肤组织,分为对照组（新鲜皮肤,不作任何保护剂处理）、海藻糖/二甲基亚砜（T/D ）组（皮肤以0.5 mol/L T/D液浸泡）、二甲基亚砜/丙二醇（D/P）组（皮肤以 D/P 液浸泡）,液氮冻存21 d,复温,Dsg2单克隆抗体免疫组化染色并用 Image Pro5.0图像分析处理系统测定皮肤组织 Dsg2表达的光密度值;用皮肤内琥珀酸脱氢酶（SDH）比色法检测皮肤组织 SDH 活性,以此表示皮肤活力。结果：低温保存21 d时,D/P组Dsg2表达（0.247±0.006）显著低于T/D组（0.250±0.009,P＜0.05）与对照组（0.254±0.007,P＜0.05）;对照组 SDH 水平为18.1±0.6,T/D组为17.4±0.9,D/P组为15.7±0.9,D/P 组 SDH 明显低于 T/D组（P＜0.01）。结论：海藻糖对皮肤组织及细胞间桥粒连接的保护作用优于传统低温保护剂。     

The effect of minimal concentration of ethylene glycol (EG) combined with polyvinylpyrrolidone (PVP) on mouse oocyte survival and subsequent embryonic development following vitrification

Purpose

Vitrification techniques employ a relatively high concentration of cryoprotectant in vitrification solutions. Exposure of oocytes to high concentrations of cryoprotectant is known to damage the oocytes via both cytotoxic and osmotic effects. Therefore, the key to successful vitrification of oocytes is to strike a balance between the usage of minimal concentration of cryoprotectant without compromising their cryoprotective actions.

Methods

The minimal concentration of ethylene glycol (EG) on mouse oocyte survival and subsequent embryonic development was evaluated following vitrification-warming and parthenogenetic activation. Polyvinylpyrrolidone (PVP) combined with EG on mouse oocyte survival and subsequent embryonic development as well as morphology of the spindle and chromosome alignment were also evaluated. Vitrification system was adapted with JY Straw and the cooling rate was approximately 442–500 °C/min. In contrast, the warming rate was approximately 2,210–2,652 °C/min.

Results

Survival rate of oocytes increased significantly when 15 % EG was combined with 2 % PVP in vitrification solution (VS). The effect of combination of EG and PVP was not significant when the concentration of EG was 20 % and higher. Although there were no significant differences in embryonic development, the percentage of abnormal spindle and chromosome alignment was significantly higher in the oocytes without 2 % PVP in VS.

Conclusions

Our data provide a proof of principle for oocyte vitrification that may not require a high concentration of cryoprotectant. There are synergic effects of EG combined with PVP for oocyte vitrification, which may provide important information to the field in developing less cytotoxic VS.     

三种不同冷冻保护剂对小鼠附睾冷冻效果的比较

目的 探讨三种不同冷冻保护剂对C57BL/6J小鼠附睾冷冻的效果。方法 性成熟并交配过的6-8周龄C57BL/6J雄鼠附睾，分别用3种不同冷冻保护剂二甲基亚砜 (DMSO)、丙二醇 (PROH)、R18S3进行玻璃化冷冻、复苏和精子采集，观察比较三个实验组的复苏精子形态、存活率以及生殖能力。结果 三组冷冻复苏分离后的精子形态完整，具有镰刀头状结构；荧光染色后PROH组精子存活率为 (88.17±3.43)%，明显高于DMSO组：(61.17±10.65)% 和R18S3组(16.83±6.49)%（P<0.05）；经辅助体外受精后均具有受精能力。获得的胚胎移植后可得到正常子代小鼠 (DMSO : PROH : R18S3 = 13 : 8 : 17）。结论 3种冷冻保护剂均适用于C57BL/6J小鼠附睾冷冻，但PROH冷冻效果较好。     

Hamster Test

A new instant cryoprotectant, mainly containing culture medium, human serum albumin, and kallikrein, and its laboratory handling in the cryoprotection of semen are described. A comparative study distributed to three cryobiological centers using either egg yolk citrate medium or instant cryoprotectant showed that neither had a significantly better or worse mean percentage recovery rate. The advantage of the new instant cryoprotectant presented consists clinically in the absence of egg yolk and technically in its easy handling. Therefore, ICP is judged as an alternative to ECM in the cryopreservation of human sperm.     

不同甘油浓度保护剂对冷冻精液复苏率的影响

目的 探讨精液冷冻保护剂中不同甘油浓度对冷冻精液复苏率的影响.方法 分别用三种不同浓度甘油的保护剂对23例合格供精者的精液进行冷冻后复苏率的检测.结果 10%甘油组冷冻复苏率为(64.4±4.1)%,8%甘油组冷冻复苏率为(69.7±4.6)%,与10%甘油组相比有显著差异(P＜0.05),6%甘油组冷冻复苏率为(77.8±5.1)%,与8%甘油相比差异显著(P＜0.05),与10%甘油组相比差异极显著(P＜0.01).结论 用6%甘油的冷冻保护剂对人类精液的冻存效果更佳.     

两组冷冻保护剂对卵裂期胚胎玻璃化冷冻效果的研究

目的：评价两组玻璃化冷冻保护剂对卵裂期胚胎的冷冻效果。方法以体外受精-胚胎移植周期患者受精后第3天废弃胚胎为实验对象,共102枚胚胎入选,随机分为乙二醇＋丙二醇（EG＋PROH）组52枚,乙二醇＋二甲基亚砜（EG＋DMSO）组50枚。比较观察两组玻璃化冷冻保护剂对卵裂期胚胎冷冻解冻后胚胎的复苏效果。结果玻璃化冻融后两组在复苏率上无显著差异,但在完整胚胎复苏率和卵裂球复苏率上EG＋PROH组显著高于EG＋DMSO组（P＜0.05）。结论对于卵裂期胚胎的玻璃化冷冻,选用EG＋PROH作为冷冻保护剂可取得较好的效果。     

血管低温保存的实验研究

血管组织的低温保存具有重要的药疗和实验研究价值。低温保存过程是离不开抗冻剂的 ;合理地选择和配制抗冻剂 ,并选取最佳降温与复温速率 ,对低温保存的成败是至关重要的。本文主要研究了在最佳降温复温过程中抗冻剂DMSO浓度变化对小牛主动脉保存后细胞活性和功能的影响。实验结果表明 :DMSO浓度为15 %时 ,血管保存效果最好 ,70 %的血管组织超微结构保存完好 ,血管对 10 -6Mnorepinephrine的收缩力达到新鲜血管的 80 %左右 ,对acetylcholine的舒张力达到 30～ 4 0 % ,动脉血管的其他功能保持完好。