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1.
《Allergologia et immunopathologia》2019,47(4):357-364
IntroductionAmaranthus retroflexus (Redroot Pigweed) is one of the main sources of allergenic pollens in temperate areas. Polcalcin is a well-known panallergen involved in cross-reactivity between different plants. The aim of this study was the molecular cloning and expression of polcalcin, as well as evaluating its IgE-reactivity with A. retroflexus sensitive patients’ sera.MethodsAllergenic extract was prepared from A. retroflexus pollen and the IgE-reactivity profile was determined by ELISA and immunoblotting using sera from twenty A. retroflexus sensitive patients. Polcalcin-coding sequence was amplified by conventional PCR method and the product was inserted into pET-21b(+) vector. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by metal affinity chromatography. The IgE-binding capability of the recombinant protein was analyzed by ELISA and immunoblotting assays, and compared with crude extract.ResultsOf 20 skin prick test positive patients, 17 patients were positive in IgE-specific ELISA. Western blotting confirmed that approximately 53% of ELISA positive patients reacted with 10 kDa protein in crude extract. The A. retroflexus polcalcin gene, encoding to 80 amino acid residues was cloned and expressed as a soluble protein and designated as Ama r 3. The recombinant polcalcin showed rather identical IgE-reactivity in ELISA and western blotting with 10 kDa protein in crude extract. These results were confirmed by inhibition methods, too.ConclusionThe recombinant form of A. retroflexus polcalcin (Ama r 3) could be easily produced in E. coli in a soluble form and shows rather similar IgE-reactivity with its natural counterpart. 相似文献
2.
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法是将PCR方法与逆转录法结合应用,可快速高效地扩增某一基因的全cDNA。类胰岛素生长因子-I(IGF-I)在人染色体中只有一个基因,全长超过45kb,并有内含子,其cDNA却只有几百个bp,为了表达得到IGF-I,本文利用RT-PCR方法,从胎肝提出的混合mRNA中,筛选并扩增了IGF-I的cDNA。经过分子克隆与测序,证明不需制备胎肝cDNA库,即可快速获得IGF-I的cDNA。 相似文献
3.
4.
目的 探讨LH基因免疫对前列腺增生模型鼠生殖内分泌的影响。方法 RT-PCR法从雌性大鼠垂体细胞中RNA扩增大鼠的促黄体素基因(LH)cDNA片段约(461bp)并克隆至T载体,获得重组质粒T-LH,限制酶酶切,酶连接,构建PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH,经脂质体转染纯化的重组质粒至COS细胞中,通过肌肉注射构建的PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH与前列腺增生大鼠,2个月内给药两次。结果 体外培养COS细胞,发现HBsAg与LH连接物表达较好,肌肉注射前列腺增生模型鼠重组质粒后,模型鼠LH与T的含量明显低于对照组。结论 PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH可参与前列腺增生模型鼠生殖内分泌腺的调节。 相似文献
5.
rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin,hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法:利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段,将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区,转化大肠杆菌M15,得到pQE30-TPO的工程菌,诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射,观察注射后不同时间血小板量的改变。结果:经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养,该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠,结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论:在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO,该产物具有促血小板生成的活性。 相似文献
6.
目的:克隆菠菜乙醇酸氧化酶cDNA并构建其酵母表达载体。方法:从新鲜菠菜叶子中提取总RNA,用RT-PCR法扩增菠菜乙醇酸氧化酶编码区cDNA并插入pMD-T载体中进行序列测定;将此cDNA构建入P.Pastoris酵母表达体系中的pPIC3.5k上的SnaBI/NotI位点,进行PCR筛选和限制性酶切鉴定。结果:测序表明获得的基因为乙醇酸氧化酶cDNA序列,与国外文献报道的序列相比有约98%的同源性;重组质粒的SnaBI/NotI双酶切证明构建正确。结论:菠菜乙醇酸氧化酶cDNA克隆及重组质粒pPIC3.5K-GO的获得,为酵母表达菠菜乙醇酸氧化酶提供了前题条件。 相似文献
7.
目的:构建表达小鼠轮状病毒(EDIM)EW株VP7基因的重组腺病毒,以在小鼠模型上研究轮状病毒的免疫保护机制。方法:用RT-PCR方法扩增EDIM VP7全长cDNA并进行基因序列分析,将所得的VP7基因片段插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttleCMV-EVP7,将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组腺病毒质粒pAdCMV-EVP7,将该质粒线性化后转染293细胞包装重组腺病毒rvAdEVP7。以rvAdEVP7感染293细胞,并分别应用电子显微镜、PCR、RT-PCR和Western blot等方法观察rvAdEVP7的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性。结果:获得了小鼠轮状病毒的全长cDNA,重组腺病毒rvAdEVP7具有典型的腺病毒形态,PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdEVP7中确有特异性的VP7基因稳定整合;有较好的遗传稳定性;感染293细胞后能有效转录;可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7。结论:成功构建含VP7基因的重组腺病毒rvAdEVP7,为进一步研究轮状病毒的免疫保护机制打下了基础。 相似文献
8.
人细胞色素p450IA1基因cDNA的克隆和鉴定 总被引:5,自引:1,他引:4
在用3-甲基胆蒽诱导培养人羊膜FL细胞24h后,抽提细胞总RNA并直接合成cDNA第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物,采用PCR技术特异性地扩增Cyt p50IA1 cDNA。30个循环后琼脂糖凝胶电泳显示1.5Kb大小片段,长度与预计相符。Southern杂交结果证实此片段确为Cyt p450IA1 cDNA。将此片段克隆至质粒pGEM-3Z并进行部份序列分析。结果显示克隆片段包含Cyt p 相似文献
9.
人自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因克隆与鉴定 总被引:2,自引:2,他引:0
目的:P58.2基因克隆与鉴定。方法:采用RT—PCR技术,从正常人外周血单个核细胞中扩增自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因全长cDNA,经酶切后构建重组克隆载体,双酶切和测序鉴定。结果:RT—PCR获得了预期的扩增产物P58.2全长cDNA,成功构建了pSPORT1-P58.2重组克隆载体,酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58.2cDNA全长碱基序列一致。结论:pSPORT1-P58.2重组克隆载体构建成功;P58.2基因序列与文献报道一致,为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。 相似文献
10.
牛IL-18基因的克隆及遗传进化分析 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:克隆牛白细胞介素18(IL-18)全基因,并对其进行序列分析。方法:从ConA刺激培养的牛外周血淋巴细胞提取总RNA,利用巢式RT-PCR方法扩增出牛IL-18全长cDNA,将其克隆到pMDl8-T载体上,测序后进行序列分析。结果:成功地克隆到了牛IL-18全基因,序列分析表明,实验中所克隆到的牛IL-18序列与GeneBank所登录的牛IL-18核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99.5%和99%。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84.9%-99.5%和74.9%~99%之间,研究结果在国内还未见报道。结论:成功地从牛外周血中克隆到了牛IL-18的基因,其全长为598bp。 相似文献