氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

从卵巢癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物

采用SEREX法筛选了自行构建的中国人卵巢癌cDNA表达文库 ,得到 2 7个阳性克隆 ,其中 3个为全长cDNA。序列分析和同源性比对结果表明所获得的 2 7个克隆分属于分化抗原、细胞结构蛋白及功能未知三类。选择其中一个全长cDNAMY OVA 13(该基因编码的蛋白是MAD2 ) ,利用基因工程方法克隆、表达和纯化得到目的蛋白 ,采用点杂交方法检测了MY OVA 13目的蛋白与正常人和肿瘤患者中的血清学反应。MY OVA 13抗体只在肿瘤组中检测到 (5 / 74 ) ,在正常组中均为阴性 ;间接ELISA测定结果显示 ,MY OVA 13抗体的水平在肿瘤组中均高于正常组 ,其中肝癌和前列腺癌组与正常组相比 ,在统计学上有显著差异 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。我们的初步结果表明MY OVA 13及其抗体具有一定的肿瘤特异性 ,有可能作为肿瘤诊断的标志物     

法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建法国梧桐花粉变应原c DNA表达文库并初步鉴定。方法利用Trizol法抽提法国梧桐花粉总RNA,经过Oligo(d T)纤维素柱纯化后分离mRNA,反转录合成ds c DNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,电泳分离并凝胶回收大于500 bp以上的c DNA片段,与Uni-ZAP XR Vector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建c DNA文库,检测文库容量和重组率,并采用PCR方法对插入的c DNA片段大小进行分析。结果成功构建了一个文库容量为3.5×106pfu/ml,重组率为94%,平均插入片段长度约为0.7 kb的法国梧桐花粉变应原c DNA表达文库。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的 c DNA,为进一步研究法国梧桐花粉主要变应原基因并制备重组标准化法国梧桐花粉主要变应原疫苗奠定基础。     

SEREX方法筛选人胎盘抗原

目的 筛选并获得来自人胎盘有潜在应用价值的抗原.方法 基于血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)技术,制备人绒毛组织免疫的兔血清,利用该免疫血清筛选人胎盘组织cDNA表达文库,通过两轮筛选得到免疫反应阳性的单克隆重组噬菌体并测序,并对所得到的序列进行生物信息学分析.结果 经过两轮筛选共得到69个阳性反应克隆,序列分析发现它们代表12种不同的基因序列,其中功能已知基因9个,功能未知基因3个,进一步分析发现绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和CSH2)有57个阳性反应克隆.占总数的82.6%,可能是一个具有重要功能的抗原基因.所筛选到的其他基因与胚胎生长发育相关.结论 SEREX技术筛选胎盘抗原是行之有效的,本实验筛选出的抗原基因对研究胚胎生长发育具有一定的意义.     

利用改良抑制消减杂交方法建立再生障碍性贫血CD4+T细胞的基因差异表达文库

目前发现T细胞介导的免疫在再生障碍性贫血(再障)发病机制中起重要作用，并且已有多个独立的研究小组从再障患外周血及骨髓中成功分离出能引起造血功能衰竭的致病相关性T细胞克隆，并证实其表型为CD4^ T细胞，但这些T细胞异常增殖、活化及抑制机体造血功能的具体机制仍不清楚。我们通过改良抑制消减杂交的方法，建立CD4^ T细胞的差异基因表达库，为揭示再障病理损伤的机制提供线索。     

肺癌候选抗原的血清反应分析及其联合检测的应用

目的：通过重组cDNA表达文库血清学分析（SER-EX）技术筛选鉴定的5种肺癌候选抗原的血清学反应及其联合检测分析,对其能否作为肺癌早期诊断的血清学标志物进行评价,并提供一个肺癌早期诊断的新方向.方法：采用重组克隆抗原表达技术扩增5种肺癌候选抗原[分别是X5：二羟基苯甲酸内脂结合蛋白1配偶体（POB1）;X18：DNA拓扑异构酶Ⅱα（Top2A）;X44：中枢神经系肽酶Ⅰ（TPP1）;X48：热休克蛋白90а（HSP90а）;X52：真核翻译延长因子1γ（eukaryotic translation elongation factor 1 gamma）],免疫印迹法检测肺癌患者血清、正常人血清中自身抗体的反应,流行病学方法对其检测结果进行评价.结果：POB1,Top2A,HSP90а3个肺癌候选抗原克隆在肺癌患者血清和正常人血清中的相应IgG抗体阳性率差别有统计学意义（P〈0.05）;3个阳性反应抗原抗体反应联合分析时,能够在保持特异度等基本不变的前提下,明显提高诊断肺癌的灵敏度,具有较大的临床诊断价值.结论：3个抗原可作为肺癌的早期诊断的候选标志物,为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向.     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。     

大肠癌中干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因表达及其临床意义

大肠癌（colorectal cancer,CRC）是消化系统常见恶性肿瘤,早期诊断还缺乏简易有效的手段,筛选大肠癌的肿瘤标志物十分必要.我们通过血清学筛选重组cDNA表达文库（SEREX）方法筛选出干扰素诱导的跨膜蛋白-1（interferon-induced transmembrane protein-1,IFITMP-1）基因,进一步研究其在大肠癌中的表达及临床意义.