中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的：克隆肿瘤特异性共享抗原mage-3基因，制备基于α－病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法：用RT-PCR方法从黑色素瘤细胞系LB373中制备mage-3基因，以含α－病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体，构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞，用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage-3蛋白的表达。结果：正确构建了mage-3/pSMART2a重组质粒，并且在转化此质粒的293细胞中检测出了mage-3蛋白的表达。结论：此重组mage-3/pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗，可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。     

TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化

目的；克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex），构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法：抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞，用RT－PCR、巢式－PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA，并克隆到pGEM-T Easy载体中，DNA测序鉴定，将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T，构建重组表达质粒pGEX/TRAILex，用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段，GST－Agarose 4B层析柱纯化GST－TRAILex融合蛋白，Western-blot鉴定纯化产物。结果：抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达，成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因，构建了重组表达载体pGEX/TRAILex，IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段，经12％SDS－PAGE分析，可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达。Kodak软件分析表达GST－TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％，进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达，用GST－Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清，每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST－Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论：成功地克隆了人TRAIL基因，并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段，为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

抑制消减杂交（SSH）在植物功能基因研究中的应用

基于PCR的抑制消减杂交（SSHPCR）是目前用于差异cDNA序列的检测，以及构建基因组差异DNA文库最有效、并且应用最广泛的方法之一。虽然这种方法有很多优点，但仍存在一定的局限性，具有一些不可避免的缺陷。从四个方面讨论SSH在植物功能基因研究中的应用，进而探讨SSHPCR方法在植物基因克隆方面遇到的问题及解决对策。     

生物信息学(2):基因工程技术简介

基因工程的特点与基本步骤 基因工程通常称为重组DNA技术（recombinant DNA technique），又称为基因克隆fgene cloning）或分子克隆fmolecular cloning），是用人工方法将外源基因与DNA载体结合形成重组DNA．然后引入某一受体细胞中，使外源基因复制并产生相应的基因产物，从而获得生物新品种的一种崭新育种技术。     

SEN病毒D亚型ORF1-C端基因的克隆、表达和鉴定

目的:获得SENV-D亚型ORF1-C端蛋白基因序列,并进行表达,为进一步研究及诊断、治疗应用奠定基础.方法:用PCR法从SENV阳性血清中获得SENV-DORF1C端基因,测序验证后,构建了pQE30-SENV-D重组表达质粒,并经过转化E.coli M15,IPTG诱导表达,Western blot分析表达结果.结果:获得了正确序列的SENV-D亚型ORF1-C端蛋白基因序列,表达出Mr约为38×103的蛋白.表达蛋白能与患者血清中相应的抗体结合,发生抗原抗体反应.结论:成功获得并表达了SENV-D-ORF1-C端蛋白,并经Western blot印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应,有可能用于检测SENV-D抗体.为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

[目的]构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达,为开展对resistin的研究打下实验基础.[方法]酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患者腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA,RT-PCR法扩增出re-sistin基因cDNA,经测序后,PCR产物亚克隆入T载体,用EcoRI和KpnI分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS,然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接,用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒.重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1 mmol/LIPTG在32℃诱导表达2 h,裂解细菌,进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]RT-PCR扩增产物分子大小为327 bp,序列分析表明为人resistin基因完整编码区.PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后,从细菌质粒中酶切回收了目的片段.重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327 bp、4 980 bp大小的两个片段,序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区,基因编码无移位,PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39.5 kD的融合蛋白.[结论]成功构建了人resistin基因原核表达载体,且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白,为下一步研究打下了实验基础.     

事件

中国医药产业发展迅速,到2010年,中国有望成为世界第5大医药市场。 亚太地区的医药企业负责人和医药专家们预计,到2005年,中国的医药     

人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。