人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗 hIL-12组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组。将基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次。采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性。用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数。对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,经ZN染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平,与BCG组相当,显著高于MS基因疫苗组,IL-4分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果。表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,但优于MS基因疫苗组。结论以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。     

hIL-2分泌肽序列在HepG2细胞中对hEndostatin表达和分泌差异的影响

目的:了解分泌肽序列在HepG2细胞中对人内皮抑素基因(hEndostatin)的cDNA表达和分泌差异的影响。方法:构建不含hIL-2分泌肽序列的真核表达载体pBlast-hEndo质粒, 转染人的HepG2细胞株, 用RT-PCR的方法检测HepG2(pBlast-hIL2-hEndo), HepG2(pBlast-hEndo), HepG2(pBlast-Mcs)和HepG2中hEndostatin的mRNA表达水平, 及制备4种细胞的总蛋白和收集各自的培养上清, 进行Westernblot分析蛋白表达和分泌的差异。结果:发现HepG2(pBlast-hIL2-hEndo)中hEndostatin的mRNA的水平显著高于HepG2(pBlast-hEndo)。而仅在HepG2(pBlast-hIL-2-hEndo)的细胞总蛋白和上清, 及HepG2(pBlast-hEndo)的细胞总蛋白中检测到hEndostatin表达, 在其它各株细胞总蛋白及上清中, 未检测到hEndostatin。结论:hIL-2分泌肽序列能促进hEndostatin基因在HepG2细胞中表达及分泌。     

tPA信号肽和鼠疫杆菌保护性抗原V融合基因的构建及免疫效果鉴定

获得含有鼠疫杆菌V抗原编码基因以及tPA信号肽编码序列的重组质粒,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。采用PCR扩增鼠疫菌杆菌V基因构建到pVAX1质粒中产生pVAX1/V重组质粒,PCR扩增tPA信号肽编码序列片段并将其插入到pVAX1/V中V基因的上游,构建tPA-pVAX1/V重组质粒;转染COS-7细胞,免疫细胞化学方法鉴定V蛋白的表达;二重组质粒分别加mGM-CSF质粒免疫BALB/c小鼠,观察免疫应答反应;以400个LD50强毒鼠疫杆菌皮下攻击免疫小鼠观察保护效率。结果显示,tPA-pVAX1/V在COS-7细胞中表达了V蛋白;免疫小鼠血清产生了特异性抗体和细胞免疫应答;攻毒保护率达80%。成功构建了分泌型V蛋白的真核表达质粒载体,具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫杆菌攻毒有一定的保护效力,为鼠疫杆菌新型疫苗研制奠定了基础。     

信号肽捕获系统及其在寄生虫学领域的应用

分泌性蛋白是生物体各组织细胞间传递信息的主要途径。因此,分离和鉴定编码分泌性蛋白的基因将会对整个生命科学的发展起到促进作用。信号肽捕获系统是一种近年发展起来的分离和鉴定编码分泌性蛋白基因的新方法,利用分泌性蛋白在N末端都含有信号肽这一特性,来特异性克隆编码这些蛋白的基因。本文主要对信号肽捕获系统的发展及其在寄生虫学领域的应用作一概述。     

口腔变形链球菌感受态刺激因子的蛋白合成及活性检测

目的探讨口腔变形链球菌(S.mutans)密度感应系统信号蛋白的体外合成及其生物活性。方法采用化学合成法口腔S.mutans密度感应感受态刺激因子(CSP)信号蛋白,通过高效液相色谱仪纯化合成蛋白,质谱分析结构,通过扫描电镜对比观察CSP信号蛋白对S.mutans生物膜形成的影响,分析CSP信号蛋白的生物活性。结果化学合成纯化S.mutans CSP蛋白分子,加入CSP信号肽后,S.mutans生物膜呈团状密集分布,细菌之间存在厚实的黏性胞外分泌物,细菌黏连呈链团状。结论成功合成口腔S.mutans CSP信号蛋白,该蛋白肽具备促进S.mutans生物膜形成的生物活性。     

1株九江分离的柯萨奇A6病毒VP1基因分析及B细胞表位预测

目的对1株在九江地区分离的柯萨奇A6病毒(CoxA6)VP1区域进行克隆,并对其编码蛋白的结构、功能及B细胞表位进行分析和预测,为CoxA6疫苗制备和诊断方法的研究提供理论基础。方法采用RT-PCR法对CoxA6分离株VP1区进行扩增和克隆、序列分析,应用SigaIP、TMPRED、TMHMM、Big-PI Predictor、Cell-Ploc、PSORT、NetNES、Netphos、SOPMA、NetNGlyc、MotifScan、InterProscan、SMART、PROSITE、GOR4、Bepipred Linear Epitope Prediction等生物信息学方法预测其VP1基因编码蛋白特性和潜在的B细胞表位。结果该CoxA6分离株VP1基因编码305aa的多肽,分子量为33.5kDa。该蛋白无信号肽、跨膜区,是亲水性蛋白;二级结构主要以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋及β-片层。该蛋白共有7个可能的B细胞抗原表位,位于151~173aa区域内的表位分值最高为2.774。结论成功克隆了1株CoxA6的VP1基因,并对其进行序列分析、蛋白质结构和B细胞表位预测,为制备CoxA6疫苗和开发诊断方法提供了分子生物学基础。     

CTGF和ELMO1多态性与2型糖尿病性肾病易感性的关联研究

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF) rs2648875及吞噬和细胞运动蛋白１(ELMO1) rs10951509多态性与2型糖尿病性肾病(DKD)的相关性。方法收集195例汉族DKD患者（DKD组）,同时选取134例健康人群作为对照组。收集两组患者的体质量、身高、血压、血生化等临床资料。采用imLDRTM多重SNP分型试剂盒检测基因多态性。结果两组患者的CTGF rs2648875基因型AA,GA和GG分布比较,差别具有统计学意义(P＜0.05);DKD组风险等位基因A频率较对照组升高(P=0.007);GG基因型患者的甘油三酯水平较AA和GA基因型患者显著降低(P<0.05)。两组患者的ELMO1 rs10951509基因型AA,AG和GG分布比较,差别具有统计学意义(P=0.034);DKD组风险等位基因A频率较对照组升高(P=0.009);AG基因型患者低密度脂蛋白胆固醇水平较AA基因型患者显著降低(P<0.05)。Logistic回归分析证实,吸烟史、腹型肥胖、收缩压、空腹血糖、尿素氮、CTGF\|AA基因型为DKD的独立危险因素。结论CTGF rs2648875及ELMO1 rs10951509与DKD的遗传易感性相关,携带CTGF rs2648875等位基因A及ELMO1 rs10951509等位基因A可增加DKD的风险     

丹红注射液对慢性肺源性心脏病患者肝细胞生长因子与肺动脉高压的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)与慢性肺源性心脏病的关系,揭示丹红注射液抑制肺动脉高压的作用机制。方法将符合诊断标准的56例肺源性心脏病患者随机分为治疗组和对照组各28例。对照组采用常规治疗,即持续低流量吸氧、抗感染、改善通气、祛痰止咳、平喘、强心利尿、扩血管、纠正水电解质紊乱与酸碱平衡失调等综合治疗。治疗组除按对照组上述方法处理外,加用丹红注射液20 ml加入5%葡萄糖或0.9%氯化钠溶液250 ml中静脉滴注,1次/d,14 d为1个疗程。两组均于治疗前后测定肺动脉压、做血气分析、判定疗效,并采血检测血浆HGF浓度。结果与对照组相比,治疗组经加用丹红注射液治疗后,患者的临床症状好转;肺动脉高压、PaCO2降低,PaO2升高(P<0.05,P<0.01),同时血浆HGF降低。结论加用丹红治疗可以明显改善慢性肺心病患者的临床症状和血气分析指标,降低肺动脉压力,同时伴随血清HGF含量的明显降低,提示丹红治疗可能通过某些途径刺激肺心病患者肺血管内皮HGF表达升高,这可能是其降低肺动脉压,发挥抗肺心病的重要作用机制之一。     

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.     

精神病药物治疗前后瘦素和脂联素的变化

目的探讨血清瘦素(Leptin)、脂联素(Adi)在精神病治疗前、后的含量变化及其在抗精神病药源性肥胖发病中的作用。方法用放射免疫、电化学发光分析法,对62例健康查体人员和125例精神病患者进行了血清Leptin、Adi等项目测定。结果治疗前精神病组血清Leptin男性为(4.79±2.69)μg/L,女性为(7.78±3.61)μg/L,与对照组比较有统计学意义(P<0.05),而Adi女性组为(6.43±3.60)mg/L显著低于对照组(P<0.05),男性组虽低但无统计学意义(P>0.05)。治疗后血清Leptin较治疗前明显升高且有统计学意义(P<0.05~0.01),Adi显著低于治疗前(P<0.01)。结论应用抗精神病药物治疗后,Leptin水平随体重的增加而增高,Adi随体重的增加而降低,两种激素对药源性肥胖的发生具有重要作用。