基于斑马鱼模型水合橙皮内酯增强免疫作用及基于网络药理学机制探讨

目的 基于模式生物斑马鱼结合网络药理学,研究枳壳的活性成分水合橙皮内酯增强免疫作用及作用机制。方法 建立2种斑马鱼免疫低下模型：以雷帕霉素建立尾部中性粒细胞数目减少模型,以酒石酸长春瑞滨建立静脉血管中巨噬细胞荧光强度减弱模型,检测水合橙皮内酯（10、20、50、100、200 μg·mL^-1）各给药组斑马鱼尾部中性粒细胞数目、斑马鱼尾部静脉血管中巨噬细胞荧光强度,计算中性粒细胞增长率和巨噬细胞改善率。基于网络药理学预测水合橙皮内酯增强免疫作用的机制,使用 Pharm Mapper、中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）进行水合橙皮内酯靶点筛选,运用Gene Cards数据库和 OMIM数据库检索增强免疫相关靶点,运用 Venny2.1将上述两组靶点取交集后导入 String数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析,进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,在 Cytoscape3.9.1软件中构建水合橙皮内酯的增强靶点 PPI网络,并以节点度值的中位数筛选关键靶点。结果 与模型组相比,水合橙皮内酯可显著增加斑马鱼尾部中性粒细胞数目（P＜0.01、0.001）、静脉血管中巨噬细胞荧光强度（P＜0.05）,证明水合橙皮内酯具有抗雷帕霉素、酒石酸长春瑞滨引起的免疫力低下作用,呈剂量相关性。水合橙皮内酯增强免疫的作用机制可能与 AKT1、EGFR、SRC、MMP9、ESR1等关键靶点及 PI3K-Akt、Rap1、AGE-RAGE等信号通路有关。结论 水合橙皮内酯具有增强免疫作用,可能通过调控PI3K-Akt、Rap1、AGE-RAGE等信号通路发挥作用。     

斑马鱼Slc26A4基因敲除品系的构建

目的 SLC26A4是大前庭水管综合征(enlarged ves-tibular aqueduct syndrome,EVAS)的致病基因,也是中国第二位致聋基因.研究发现SLC26A4突变能够导致Pendred综合征(PS),包括甲状腺肿、听力丧失和前庭导水管增大,但其具体的分子机制尚不清楚.为了研究该基因在内耳发育...     

冠心宁片中水溶性组分的抗血栓活性研究

目的:使用转基因斑马鱼模型筛选冠心宁片中具有抗血栓活性的组分及药效物质,并探讨其作用机制。方法:将斑马鱼胚胎分为对照组、造模组、给药组及阳性药组,使用苯肼诱导血栓模型。通过荧光显微成像结合血红蛋白染色对冠心宁片各组分抗血栓作用进行定性和定量分析。进一步探寻活性组分中起抗血栓作用的主要成分。最后进行活性氧（ROS）检测及脂质氧化损伤丙二醛(Malondialdehyde,MDA)分析,探讨其抗血栓机制。结果:实验结果显示冠心宁片水溶性组分可显著减少外周血红细胞聚集(P<0.01),增加回心血量,且效果呈剂量依赖性。因多糖为冠心宁片水溶性成分中的主要物质,进一步实验发现丹参多糖和川芎多糖也具有抗血栓活性,且能显著降低斑马鱼的氧化应激水平,丹参多糖还具有下调胚胎脂质过氧化水平的作用。结论:丹参多糖和川芎多糖为冠心宁片水溶性组分中具有抗血栓作用的活性化合物,可能与其抑制氧化应激作用有关,具有开发为抗血栓治疗先导物的潜在应用前景。     

谷精草提取物对6-OHDA所致PC12细胞及斑马鱼神经损伤模型的保护作用

目的探讨谷精草乙醇提取物(Eriocaulon buergerianum extract,EBE)对6-羟基多巴胺(6-hydroxy-dopamine,6-OHDA)在PC12细胞和斑马鱼上引起的神经损伤的保护作用及其机制。方法采用4-甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)和乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测PC12细胞的活力;Hoechst 33324荧光染色观察细胞核形态的改变分析细胞凋亡;DAF-FM diacetate荧光染色检测细胞内一氧化氮(NO)的含量;采用免疫印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS蛋白)的表达水平。免疫染色方法观察斑马鱼脑部多巴胺神经元的变化。结果 EBE能够剂量依赖性的提高6-OHDA损伤的PC12细胞的存活率,减少6-OHDA引起的PC12细胞凋亡。免疫染色的结果表明EBE可以抑制6-OHDA在斑马鱼上所引起的多巴胺神经元的减少。作用机理研究证明EBE能够降低6-OHDA刺激的PC12细胞内NO含量增加。免疫印记杂交的结果显示EBE能够降低iNOS的表达。结论 EBE对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,能减少6-OHDA引起的细胞凋亡,并且可以抑制6-OHDA在斑马鱼上引起的多巴胺神经元减少,其作用机制可能与降低NO的产生和iNOS的表达量有关。     

瓜蒌不同部位对斑马鱼促血管生成及心脏保护作用

目的采用斑马鱼模型探讨中药瓜蒌不同部位对心脏保护和促血管生成作用,为阐明瓜蒌的药效物质基础及作用机制提供研究基础。方法瓜蒌药材粉碎后用70%乙醇提取、浓缩,然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。以TG(VEGFR2∶GFP)系荧光转基因斑马鱼为模型动物,将瓜蒌总样和不同萃取部位设置不同质量浓度,观察他们对斑马鱼体节间血管(intersegmental vessels,ISV)数和心率的影响。结果 10μg/mL正丁醇萃取物和1μg/mL水层样品具有促进斑马鱼体间血管数生成活性;石油醚萃取物和总样对特非那定引起的心脏毒性具有明显的改善作用。结论瓜蒌能促进斑马鱼的血管生成并具有心脏保护作用。     

基于斑马鱼模型比较宽体金线蛭和菲牛蛭对血管新生的影响

摘 要 目的：探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼的血管新生影响。方法: 将受精后 6 ~ 8 h（6 ~ 8hpf）的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液。72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率。结果: 在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30 μg· ml^-1时,菲牛蛭组浓度≥20 μg· ml^-1时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少（P<0.01）。毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40 μg· ml^-1时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低（P<0.01）;在72 hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100 μg·ml^-1时较空白组明显降低（P<0.01）,而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80 μg· ml^-1就明显降低（P<0.01）。宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低（P<0.01）,但在正常心率范围内。结论: 宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭。两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大。     

斑马鱼在中药研究中的应用

斑马鱼模型作为一个整体的动物模型,其体积小、高通量、费用低、周期短,且实验结果可靠,在药物研究领域广泛应用。中药是一个复杂的系统,其有效成分及作用机制是中药现代化发展的研究热点之一,随着先进技术和方法的不断改进,斑马鱼在中药研究中的应用逐渐深入,并且已经在活性筛选、毒理、代谢研究等方面表现出优越性。该文主要介绍了近年来斑马鱼在中药研究中应用的概况,以期能为中药基础研究提供新的思路和方法。     

基于模式生物斑马鱼研究姜黄抗血管新生的作用及机制

目的利用模式生物斑马鱼研究姜黄Curcuma longa抗血管新生作用,并采用网络药理学和分子对接技术探究姜黄抗血管新生的作用机制。方法采用模式生物斑马鱼模型,考察姜黄挥发油、姜黄素以及姜黄水提液对斑马鱼节间血管生长的抑制作用,检测各给药组斑马鱼节间血管生成数,计算血管生成抑制率。利用网络药理学和分子对接技术预测姜黄抗血管新生的作用机制,构建"药物-成分-靶点"网络和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析;通过AutoDock vina软件对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。结果姜黄挥发油、姜黄素以及姜黄水提液均可明显抑制斑马鱼血管新生(P<0.05),呈剂量相关性,其中姜黄素抑制血管生成作用最强。网络药理学预测发现姜黄共有21种主要活性成分,可通过调节前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS...     

视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化

目的观察外源性视黄酸对斑马鱼心脏前后轴发育即心脏房室分化的影响。方法采用化学遗传学方法在斑马鱼胚胎发育至12.5hpf(hours post fertilization)给予5×10-8mol/L和10-7mol/L外源性视黄酸处理1.5h。应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸对心脏特异基因vmhc,amhc,nkx2.5和nppa表达的影响。结果vmhc,amhc探针的整体原位杂交结果显示视黄酸处理会导致斑马鱼胚胎心脏的前后轴发育异常,表现为vmhc表达细胞的范围缩小,amhc表达细胞的范围明显增大。视黄酸可以明显增强nppa在心脏的表达。视黄酸对心脏房室分化的影响在48hpf后表现得明显。结论5×10-8mol/L和10-7mol/L视黄酸在12.5hpf处理斑马鱼胚胎对斑马鱼心脏早期发生没有影响。斑马鱼发育过程中,视黄酸对心脏的房室分化过程起着重要的调控作用,视黄酸支持心房的分化和发育,同时抑制心室发育。     

溴隐亭对斑马鱼胚胎早期发育的影响

目的 探讨溴隐亭对斑马鱼胚胎生存率、孵化时间和形态发育异常的影响。方法 取斑马鱼胚胎随机分成溴隐亭溶液组（10μmol/L组、20μmol/L组、50μmol/L组、100μmol/L组）,control组（空白对照组）和0.5%二甲基亚砜（DMSO）对照组,比较各组胚胎生存率、孵化时间、幼鱼鱼鳔充气、幼鱼畸形及发育异常情况。结果 48受精后发育小时数（HPF）时,溴隐亭溶液组胚胎孵化率低于2个对照组（P<0.05）;120 HPF时,20μmol/L组、50μmol/L组、100μmol/L组斑马鱼幼鱼鱼鳔充气率、水肿率分别低于、高于其余组（P<0.05）,但各组畸形率比较,差异无统计学意义（P>0.05）;144 HPF时,50μmol/L组、100μmol/L组较其余4组斑马鱼幼鱼生存率降低（P<0.05）。结论 高浓度溴隐亭可引起斑马鱼胚胎孵化延迟、斑马鱼幼鱼生存率降低、水肿及鱼鳔充气障碍,但对斑马鱼胚胎发育畸形则无影响。