抗体工程与病理学

结合抗肝癌基因工程抗体的制备，概述了抗体工程的工作内容及其与病理学的关系，抗体工程的主要目的之一是制备人的或接近人的，而能在病人体内应用的抗体，一方面它可以来源于单克隆抗体的改造，首先克隆出鼠抗体可变区的轻链及重链成为小抗体或重组成单链抗体及人鼠嵌合抗体等基因工程抗体。另一方面，也可以用免疫过的小鼠脾细胞或者人的淋巴细胞建立鼠、人抗体库，然后抗原从抗体库中筛选出鼠或人的各种类型抗体。鉴于抗体对靶细胞一般只起导向作用，要携带效应分子才发挥杀伤肿瘤细胞的作用或其它作用。常用的“弹头”有毒素及细胞因子等。所以必须将这种基因与抗体基因融合在一起才能表达有作用的融合蛋白。抗体工程还包括抗体的增效或抗体的成熟，以及对照人抗体的结构进行置换，使抗体人源化等。     

ATP结合盒转运体基因在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中的表达

目的 分析ATP结合盒转运体基因在鼻咽癌细胞对紫杉醇产生耐药过程中的作用.方法 采用大剂量紫杉醇冲击和逐渐增加剂量相结合的方法建立鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol,运用包含49个ATP结合盒转运体家族成员的Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/Taxol及其亲本细胞系CNE-1 之间的基因表达差异.结果 发现了ABCA7、 ABCB10、ABCC1、 ABCC4、ABCC5、 ABCC6、ABCD4和ABCG2八个在耐药细胞中表达上调2倍以上的ATP结合盒转运体基因,这些基因在CNE-1/Taxol的表达随半数抑制剂量的紫杉醇处理后均表现不同程度的下降.结论 ATP结合盒转运体家族成员的上述8个基因可能与鼻咽癌细胞的紫杉醇耐药产生有关.     

DNA拓扑异构酶在卵巢癌细胞拓扑替康耐药中的作用

目的 探讨DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)在卵巢癌拓扑替康(TPT)耐药细胞A2780/TPT中的作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测该细胞株对TPT、米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、顺铂(cDDP)的耐药指数.Western blot法检测Topo Ⅰ及TopoⅡ的蛋白含量,超螺旋DNA松解法检测Topo Ⅰ的酶活性.结果 A2780/TPT细胞对Topo Ⅰ抑制剂TPT及CPT的耐药指数分别为25.1及3.1,对MX的耐药指数为19.0,对cDDP及Topo Ⅱ抑制剂ADM、VP-16仍保持敏感.耐药株的Topo Ⅰ含量约为亲本细胞的40%,且Topo Ⅰ活性下降(P<0.05),而TopoⅡ含量约为亲本细胞的2.2倍(P<0.05).结论 Topo Ⅰ含量的下降及TopoⅡ含量的增加是卵巢癌TPT耐药细胞对Topo Ⅰ抑制剂及Topo Ⅱ抑制剂产生不同药敏情况的原因.     

鲍氏针层孔菌原生质体融合育种的研究

目的：鲍氏针层孔菌优良菌株的选育。方法：通过5.8SrDNA-ITS序列,生长速度、液体发酵生产菌丝体和胞外多糖产量等方面,对不同来源的菌株进行分析比较,筛选出优良的亲本菌株。在此基础上,采用双灭活标记,原生质体PEG诱导融合的方法。结果：筛选出亲本菌株SA02和SA04,以及编号为R002、R003、R005等三个融合菌株与两亲本菌株都具有拮抗反应,且菌落性状表现出不同于亲本的性状。结论：R002、R003和R005初步确定为双亲株的融合子。     

原生质体融合技术选育高效菌株降解聚乙烯醇

从自然界中分离聚乙烯醇(PVA)的降解细菌，经紫外线诱变，得到两株具有单重抗药性的突变菌株S7(Str^s，Kan^r)和K15(Str^r，Kan^s)，两者对PVA的去除率分别达到52％和58％．将S7和K15作为亲本菌株进行原生质体融合，并对融合条件进行优化，融合子F4菌株对PVA去除率达到79．9％，将其培养成活性污泥后，PVA去除率可达87％，是普通活性污泥的三四倍．     

板蓝根活性成分对肝癌耐药细胞耐药性的逆转作用研究

目的　研究板蓝根提取物对人肝癌耐药细胞株BEL - 74 0 4 /ADM耐药逆转作用及其逆转机制。方法　用人肝癌细胞株BEL - 74 0 4 /ADM筛选出板蓝根活性单体 ,进行耐药逆转试验 ;使用高效液相色谱仪 (HPLCA)测定细胞内药物含量 ,来探讨其逆转机制。结果　 (1)板蓝根活性单体 5b在高浓度 (>5 0 0 μg/ml)时对亲本细胞及耐药细胞均有细胞毒作用 ,抑制率大于 5 0 % ,在非细胞毒剂量 (<2 5 0 μg/ml)与阿霉素合用后能逆转BEL - 74 0 4 /ADM对阿霉素的耐药性 ,逆转倍数为 2～ 6倍 ;(2 )阿霉素与 5b合用时细胞内阿霉素含量较单独应用时明显升高 (P <0 0 0 1) ,分别为 5 6 .875± 9 349pg和 19 6 2 5± 0 .6 2 9pg。 结论　板蓝根活性单体 5b在非细胞毒剂量范围内能逆转BEL - 74 0 4 /ADM对阿霉素的耐药性 ,其逆转作用可能与降低 p - gp药物外排功能、增加细胞内药物浓度有关     

luxAB发光基因标记的铜绿假单胞菌株的构建

目的构建表达luxAB发光基因的铜绿假单胞基因工程菌。方法用BglⅡ酶切pUC-luxAB质粒,回收luxAB片段与BamHⅠ酶切的质粒载体pBBR1MCS-5连接形成重组质粒pBBR-luxAB,再转化E.coliDH5α感受态细胞,经庆大霉素抗性、氯霉素抗性、发光检测多重筛选含有pBBR-luxAB重组质粒的的阳性克隆,并设立对照菌株。抽提pBBR-luxAB质粒、酶切、凝胶电泳,验证质粒构建的正确性。通过二亲本杂交方式将pBBR-luxAB质粒导入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),构建基因工程菌铜绿假单胞菌(pBBR-luxAB)并对其进行质粒传代稳定性、发光动力学曲线以及发光度和活菌数关系进行测定。结果成功构建pBBR-luxAB重组质粒并且确定其成功转入铜绿假单胞菌中,连续转接4次后质粒保持率仍可达93%。在加入底物20min后,重组菌发光强度趋于稳定水平(1.32mV/ml),其发光强度与活菌量呈显著正相关(r=0.96,P<0.05)。结论该研究成功构建luxAB发光基因标记的铜绿假单胞菌(pBBR-luxAB)。     

卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制探讨

目的 为探讨卵巢癌细胞多药耐药的发生机制,寻找克服卵巢癌耐药的方法而建立人卵巢癌紫杉醇(TAX)耐药细胞株SKOV3/TAX.方法 选用卵巢癌细胞株SKOV3,以浓度为300ug/ml的TAX反复大剂量冲击用药,培养8个月后建立TAX耐药细胞株,命名为SKOV3/TAX.该细胞已反复传代3个月以上.结果 SKOV3/TAX细胞耐药性稳定,耐药指数(RI)为10.57.除对紫杉醇耐药外,对环磷酰胺(CTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、足叶乙甙(VP-16)有明显的交叉耐药,与亲本细胞相比,细胞倍增时间明显缓慢(P<0.01),G2/M期明显高于亲本细胞,S期比例明显降低(P<0.05),细胞内P糖蛋白(P-gp)表达增加.产生耐药的机制可能与细胞周期改变、细胞凋亡及P-gp的表达增加,导致细胞内TAX聚集量减少有关.结论 SKOV3/TAX细胞耐药性稳定,具有典型的多药耐药表型.     

用自制抗HRP－抗HBc双特异性单克隆抗体检测抗HBc的初步应用

用杂交瘤融合法建立了抗ＨＲＰ－抗ＨＢｃ双特异性单克隆抗体（ＢｓＡｂ）杂交－杂交瘤细胞系，它分泌的腹水抗体经ＦＰＬＣ－离子交换层析梯度盐洗脱呈现三个主峰，抗体活性检测表明依次为抗ＨＲＰ、ＢｓＡｂ及抗ＨＢｃ。试用ＢｓＡｂ－ＨＲＰ复合物检测乙肝病例血样，与市售试剂盒初步比较，效果满意。