Design of Dendrimer Modified Carbon Nanotubes for Gene Delivery

Objective: To investigate the efficiency of polyamidoamine dendrimer grafted carbon nanotube (dendrimer-CNT) mediated entrance of anti-survivin oligonucleotide into MCF-7 cells, and its effects on the growth of MCF-7 cells. Methods: Antisense survivin oligonucleotide was anchored onto polyamidoamine dendrimer grafted carbon nanotubes to form dendrimer-CNT-asODN complex and the complex was characterized by Zeta potential, AFM, TEM, and 1% agarose gel electrophoresis analysis. Dendrimer-CNT-asODN complexes were added into the medium and incubated with MCF-7 cells. MTT method was used to detect the effects of asODN and dendrimer-CNT-asODN on the growth of MCF-7 cells. TEM was used to observe the distribution of dendrimer-CNT-asODN complex within MCF-7 cells. Results: Successful synthesis of dendrimer-CNT-asODN complexes was proved by TEM, AFM and agarose gel electrophoresis. TEM showed that the complexes were located in the cytoplasm, endosome, and lysosome within MCF-7 cells. When dendrimer-CNT-asODN (1.0 μmol/L) and asODN (1.0 μmol/L) were used for 120 h incubation, the inhibitory rates of MCF-7 cells were (28.22±3.5)% for dendrimer-CNT-asODN complex group, (9.23±0.56)% for only asODN group, and (3.44±0.25)% for dendrimer-CNT group. Dendrimer-CNT-asODN complex at 3.0 μmol/L inhibited MCF-7 cells by (30.30±10.62)%, and the inhibitory effects were in a time- and concentration- dependent manner. Conclusion: Dendrimer-CNT nanoparticles may serve as a gene delivery vector with high efficiency, which can bring foreign gene into cancer cells, inhibiting cancer cell proliferation and markedly enhancing the cancer therapy effects.     

新基因NBEAL1的克隆、表达、纯化及其与胶质瘤病理分级的相关性

目的：构建新基因neurobeachin like 1（NBEAL1）的表达载体,研究NBEAL1 的表达与胶质瘤病理分级的相关性。方法：提取人脑胶质瘤细胞U251的总RNA,构建pGEX-KG/NBEAL1表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导NBEAL1重组蛋白的表达,GST亲和纯化,Western blotting鉴定重组蛋白的纯度;以免疫组化法用纯化蛋白制备的单克隆抗体分析NBEAL1表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：NBEAL1基因片段被成功地克隆入pGEXKG表达载体,测序证实克隆片段序列正确。NBEAL1融合蛋白在大肠杆菌BL21包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度95%以上。Western blotting证明所纯化的蛋白含有GST标签与NBEAL1肽段。免疫组化法检测显示NBEAL1蛋白的表达在正常脑组织中较低,而在低级别的脑胶质瘤组织中表达明显上调,但随着恶性程度增加NBEAL1的表达程度降低,两者呈负相关。结论：成功地克隆、表达及纯化NBEAL1蛋白,NBEAL1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达与其恶性程度呈负相关。     

沉默BRCAA1基因对胃癌MGC-803细胞的抑制作用及其可能的机制

目的：研究沉默乳腺癌相关抗原1（breast cancer—associated antigen1，BRCAA1）基因对胃癌细胞株MGC-803的抑制作用及其可能的机制。方法：构建BRCAA1基因shRNA载体，将构建的shRNA—BRCAAI质粒与阴性对照质粒shRNA—N转染胃癌MGC-803细胞，24h后用荧光显微镜观察转染效率，实时定量PCR检测BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平。MTT法检测转染后24、48与72h的细胞增殖水平，Annxin—VPE／7AAD检测转染24h后的细胞凋亡水平，Westernblotting检测转染48h后细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果：BRCAA1siRNA表达质粒转染MGC-803细胞24h的转染效率为（81．2±2．6）％。转染后48hMGC．803细胞的BRCAA1mRNA水平下降了61．4％，MGC-803细胞增殖的抑制率达45．0％，转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞[（14．4±1．6）％vs（5．4±2．0）％，（4．4±2．5）％，P〈0．05]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P〈0．05），Bcl-2的表达量显著减少（P〈0．05）。结论：BRCAAI基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC．803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达有关，     

基因对胃癌MGC 803细胞的抑制作用及其可能的机制

目的:研究沉默乳腺癌相关抗原1（breast cancerassociated antigen 1,BRCAA1)基因对胃癌细胞株MGC803的抑制作用及其可能的机制。方法：构建BRCAA1基因shRNA载体，将构建的shRNABRCAA1质粒与阴性对照质粒shRNAN转染胃癌MGC803细胞，24 h后用荧光显微镜观察转染效率，实时定量PCR检测 BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平。MTT法检测转染后24、48与72 h的细胞增殖水平，AnnxinV PE/7AAD检测转染24 h后的细胞凋亡水平，Western blotting检测转染48 h后细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果：BRCAA1 siRNA表达质粒转染MGC803细胞24 h 的转染效率为（81.2±2.6）％ 。转染后48 h MGC803细胞的BRCAA1 mRNA水平下降了61.4％，MGC803细胞增殖的抑制率达45.0%，转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞\[（14.4±１.6）% vs（5.4±2.0）％，（4.4±2.5）％，P<0.05\]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P<0.05），Bcl2的表达量显著减少（P<0.05）。结论：BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达有关。     

树形分子递送survivin反义寡核苷酸对HepG2细胞的抑制效应

目的:研究利用聚酰胺(polyamidoamine,PAMAM)树形分子递送survivin基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxy- nucleotide,asODN)抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的效应。方法:采用第1至第5代的聚酰胺树形分子室温下与反义survivin寡核苷酸混合制备树形分子与反义寡核苷酸的复合物(PAMAM-asODN),应用琼脂糖凝胶电泳及原子力学显微镜观察复合物的形态结构。PAMAM-asODN复合物转染HepG2细胞,同时设survivin反义寡核苷酸转染细胞作对照。共聚焦荧光显微镜检测复合物细胞转染效果;RT-PCR分析转染后细胞survivin mRNA的表达水平;MTT法检测复合物对HepG2细胞增殖的抑制效应。结果:琼脂糖凝胶电泳分析表明,树形分子与survivin反义寡核苷酸具有高效络合作用,形成了大小为25 nm左右的复合物;共聚焦荧光显微镜检测显示,与对照相比,PAMAM-asODN复合物转染细胞的效率显著提高;RT-PCR的结果表明,转染PAMAM-asODN复合物的肿瘤细胞中survivin mRNA表达显著降低;MTT结果表明,树形分子递送survivin反义寡核苷酸进入细胞后,HepG2细胞增殖明显受抑制,增殖抑制率随培养时间、复合物浓度、树形分子代数的增加而增加,6.0μmol/L G4.0 PAMAM-asODN与细胞培养96h可使抑制率达55%以上。结论:PAMAM树形分子能高效递送survivin asODN进入细胞,并抑制HepG2肿瘤细胞的增殖。树形分子可能是一种高效基因药物递送载体,在肿瘤治疗中具有潜在应用价值。     

ICU重症患者中等长度静脉置管专项管理

目的 总结ICU危重症患者应用中等长度静脉置管治疗的专项管理经验.方法 对入住ICU的33例危重症患者,行中等长度静脉置管,实施置管评估、部位选择、置管维护和并发症预防处置等专项管理措施.结果 33例患者均穿刺成功,一次性穿刺成功率87.88％;发生动脉损伤1例,导管堵塞3例,均经积极处置未发生严重后果.结论 对行中等长度静脉治疗的ICU危重患者,实施专项管理,操作成功率高、并发症少,能满足患者静脉治疗需要.     

HIV-1 env蛋白的制备活性鉴定与快速检测方法的建立

目的 制备具有生物活性的HIV-1 env蛋白,利用量子点的特殊光学性能结合免疫分析技术,建立快速、简便的免疫凝集分析检测HIV-1 gp41抗体方法.方法 以HIV-1 env基因质粒为模板,采用体外快速翻译系统(RTS)线性模板试剂盒制备线性模板,用RTS100试剂盒合成env蛋白,用磁珠法纯化蛋白,用Western Blot方法鉴定蛋白活性.纯化后的HIV-1 env蛋白采用量子点标记,与样品液中的抗HIV-1 gp41抗体进行免疫反应,根据量子点的荧光信号的变化,定量检测样品液中抗gp41抗体的浓度.结果 体外快速翻译系统表达出相对分子量约为97KD的env蛋白;Westem blotting证实纯化后的蛋白具有生物活性,量子点标记的env蛋白与山羊抗HIV-1 gp41抗体发生了免疫凝集反应.使量子点发生荧光淬灭,荧光信号强度与抗体浓度呈负相关.结论 HIV-1 env蛋白可采用RTS系统进行大量表达,分离纯化后的env蛋白具有生物学活性,建立的量子点标记的免疫凝集反应方法检测HIV gp41结果准确,方法简便.     

人黑素瘤单链抗体-量子点纳米探针的制备及其与黑素瘤细胞特异性结合

目的：制备抗人黑素瘤细胞单链抗体与碲化镉量子点(CdTe guantun dot, CdTe)连接的纳米探针,观察其对恶性黑素瘤细胞的特异性结合效果。方法：将抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体（antihuman melanoma ganglioside single chain variable fragment antibody,GD/ScFvMEL）基因克隆到pET32a（+）载体中,然后在BL21（DE3）细菌中进行诱导表达,采用变性法纯化表达的蛋白,再用改良的透析法复性目的蛋白,SDSPAGE分析表达的GD/ScFvMEL抗体蛋白。制备的GD/ScFvMEL抗体与量子点连接制备成纳米探针GD/ScFvMELQDs,然后与黑素瘤A375细胞株及胃癌MGC803细胞株孵育,观察纳米探针与肿瘤细胞结合的特异性。结果：PCR、双酶切和序列测定证实重组子的拼接完全正确,SDSPADE结果显示,GD/ScFvMEL抗体的表达量达40%。纯化复性后的GD/ScFvMEL抗体连接量子点制备GD/ScFvMELQDs纳米探针,经扫描电镜、X衍射分析、荧光光谱和SDSPAGE分析证实纳米探针的成功制备。GD/ScFvMELQDs纳米探针能特异性结合A375黑素瘤细胞,不与胃癌细胞MGC803细胞结合。结论：成功制备抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体量子点纳米探针,该探针可特异性结合黑素瘤细胞。