凋亡相关蛋白Apr-2的克隆、测序及初步表达

目的: 从HL-60细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr-2编码区基因,并对其进行表达,为进一步研究Apr-2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础.方法: 建立HL-60细胞凋亡模型,提取HL-60凋亡细胞总RNA,以RT-PCR方法获取Apr-2 cDNA编码区全序列,将其与PGEM-T Easy载体连接,转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体PGEM-TEasy/apr-2,测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,并转化大肠杆菌, IPTG诱导重组蛋白质表达,分析蛋白质在细菌中的表达分布,进行凝胶自动扫描分析. 结果:序列分析表明,与GenBank中已登录的Apr-2 cDNA编码区序列比较,完全一致.表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上,主要以包涵体的形式存在. 结论:成功的获得了细胞凋亡模型HL-60中Apr-2 cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物.     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

PRL-2基因转染对肝细胞增殖及细胞周期的影响

目的：研究PRL-2基因对肝细胞增殖和细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中，G418筛选阳性克隆。应用实时荧光定量聚合酶链反应、Western印迹和免疫组化分析PRL-2在阳性细胞的表达及蛋白定位，MTT法检测细胞的群体倍增时间，流式细胞仪检测细胞周期变化，Western印迹分析细胞周期素A、D1、E以及周期蛋白依赖激酶抑制因子p16、p21WAF1及p27Kip1的变化,实时荧光定量聚合酶链反应检测p21WAF1mRNA的变化。结果: 成功构建PRL-2真核表达载体pcDNA3-PRL-2。脂质体转染细胞经过G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1。经实时荧光定量PCR、Western印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系PRL-2基因及蛋白表达水平高于对照组，流式细胞仪检测细胞周期S期细胞比例明显增高，MTT法检测细胞群体倍增时间缩短。Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应显示p21WAF1在转染后较对照组明显降低，细胞周期素A、D1、E及p16、p27Kip1无明显变化。结论: 重组PRL-2真核表达载体构建正确,并在永生化肝细胞中获得稳定、高效表达。PRL-2基因具有促进细胞增殖的作用，这种作用与其降低p21WAF1蛋白含量相关。     

液质联用分析肝癌细胞HLA Ⅰ类分子递呈的抗原肽

0 引言HLA-抗原肽是抗原经过抗原递呈细胞(APC)加工后,由HLA分子递呈给T细胞抗原受体(TCR)的短肽. 寻找能够为T细胞所识别的HLA结合肽对于肿瘤免疫学研究及肿瘤有效防治具有重要的理论意义和应用价值,许多国家都在致力于这一领域的研究. 细胞HLA-抗原肽含量很少,分子量很小,难于纯化和测序,是免疫学研究的一个难点. 我们应用肝癌细胞膜酸洗技术及高效液相色谱与质谱联用技术首次分析和鉴定了一条为HLA-A2递呈的肝癌抗原肽.     

肝癌细胞实验室大量培养的方法及其质控

目的:探讨以提取肝癌抗原肽为目的的肝癌细胞实验室大量培养方法及其质量控制。方法:先利用普通培养瓶在CO_2孵箱中进行少量培养,再接种到10L转瓶进行旋转培养;FCM检测MHC-Ⅰ类抗原表达。结果:细胞数增加1～9倍,不仅保持了MHC-Ⅰ类抗原的表达量,而且,培养细胞质量高、好。结论:建立了用于制备肝癌抗原肽的肝癌细胞实验室大量培养方法。     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

伴有偏头痛的卵圆孔未闭封堵患者的疗效研究

目的:探讨经皮卵圆孔未闭(PFO)封堵的可行性,为开展此项工作提供理论基础。方法:采用自身对照,收集患者术前术后的HIT-6头痛评分量表得分、手术前后的超声心动图、TCD发泡实验结果、血常规中血小板含量。采集患者术前1h内行Valsalva动作或咳嗽后的股动脉及股静脉血样,术后1d股动静脉血样。并对术后患者规范随访至少1年。结果:动脉血中五羟色胺(5-HT)含量术后较术前明显降低(t=4.877,P0.05),而静脉血中5-HT含量术后与术前比较无明显差异(t=0.063,P0.1)。患者HIT-6得分术后与术前对比,术后偏头痛对生活的影响程度明显降低(t=10.511,P0.05)。TCD发泡实验结果与HIT-6评分资料分级进行Spearman秩相关分析结果显示:一致性分析结果:χ~2=44.69,P=0.020.05,相关系数r=0.74,P=0.000.05,表明栓子信号数量越多,患者头痛越严重。结论:对于存在PFO的严重偏头痛患者而言,行经皮PFO封堵手术治疗能减轻偏头痛的影响。     

超声造影剂促进野生型p53基因转染抑制大鼠卵巢癌生长的实验研究

目的 探讨超声辐照造影剂微泡促进野生型p53基因转染进而抑制大鼠卵巢癌生长的有效性。方法构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，将40只卵巢癌荷瘤大鼠分成4组。第1组瘤体内注入造影剂微泡和野生型p53质粒混合物，并用超声辐照大鼠腹部瘤区；第2组注入裸质粒后予以超声辐照瘤体；第3组注射超声造影剂和基因混合物后无超声辐照；第4组仅注入裸质粒而无超声辐照。每组进行基因转染每周1次，共进行8次。2月后用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测野生型p53 mRNA在卵巢癌组织中的表达，Western Blot检测野生型p53基因蛋白表达。结果成功构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，埋线法建立卵巢癌动物模型；用超声波辐照微泡促进基因转染后见p53基因转录及表达。第1组p53 mRNA的表达明显增强，高于其他3组，约是第2组的2．65倍，第4组的5．95倍。第2组高于未行超声辐照组，是第4组的2．23倍。第3、4组基因表达差异无统计学意义；Western Blot分析示p53基因蛋白表达的差异模式基本同mRNA，即第1组p53 mRNA的表达增强，高于其他3组，约是第2组的1．75倍，第4组的3．13倍；第2组高于未行超声辐照组，是第4组的1．79倍；第3、4组基因表达差异无统计学意义。结论瘤体内注射造影剂微泡和野生型p53质粒混合物后行超声辐照，可明显增加质粒基因在癌瘤组织中的导人及表达，超声联合造影剂微泡可作为卵巢癌基因治疗中促进基因转移的辅助方法。     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.