化疗诱导损伤相关分子模式强化CIK对肺癌A549 细胞的抑制作用

目的：探讨化疗诱导损伤相关分子模式（damaged associated molecular patterns,DAMP)对CIK 细胞抑制RAS 突变A549 肺腺癌细胞的影响及其机制。方法：体外分离人外周血单个核细胞且培养CIK 细胞,以顺铂（cisplatin,DDP）和多柔比星（doxorubicin,ADM）单独或联合作用于A549 细胞,镜下观察A549 细胞的形态,将药物后的A549 细胞上清加入CIK细胞共培养,流式细胞术检测共培养后CIK 细胞免疫表型,MTT 实验检测A549 细胞上清诱导CIK 细胞对A549 肺腺癌细胞增殖的抑制,ELISA实验检测多种浓度化疗药物杀伤A549 细胞上清中CRT、ATP、HMGB1 含量。结果：低质量浓度化疗药杀伤A549 细胞后呈现较多的免疫原性死亡特征。杀伤后A549 细胞上清加入CIK 细胞共培养使CIK 细胞CD8+、CD56+的比例较对照CIK 细胞明显升高（均P<0.05）。A549 细胞损伤后上清诱导CIK细胞对A549 肺腺癌细胞增殖抑制率明显高于同质量浓度化疗药组[DDP组（31.34±1.51）% vs（5.97±1.74）%,ADM组（45.46±1.78）% vs（6.22±1.34）%,DDP+ADM组（45.78±1.14）% vs（11.94±3.11）%,均P<0.05],并且低质量浓度化疗药物杀伤A549 细胞上清诱导的CIK对A549 细胞的抑制率高于较高浓度化疗药物杀伤后细胞上清诱导的CIK（均P<0.05）。低质量浓度化疗药物杀伤A549 细胞上清中免疫原性死亡相关分子CRT、ATP、HMGB1 含量增加得最多（均P<0.05）。低质量浓度组该上清诱导的CI 对A549 肺腺癌细胞的增殖抑制率随着CRT、ATP、HMGB1 水平的增高而增加。结论：较低质量浓度的DDP和ADM单独或联合用药更易引起A549 细胞免疫原性死亡并释放较高水平的DAMP分子,能更强的促进CIK对肺癌A549 细胞的抑制作用。     

负载肺癌干细胞膜微粒的 DC －CIK 对耐药肺癌细胞的靶向杀伤作用及对肺癌干细胞凋亡的影响

目的：探讨负载肺癌干细胞膜微粒的 DC －CIK 细胞对 EGFR －TKI 耐药肺癌细胞的杀伤作用及对肺癌干细胞凋亡的影响机制。方法：无血清悬浮细胞培养法富集 EGFR －TKI 耐药肺癌细胞 A549、H292干细胞样细胞,RT －PCR 检测干细胞标志物,裸鼠成瘤实验鉴定致瘤性。超滤和差速离心法获取肺癌干细胞膜微粒。流式细胞术分别测定共孵育组和常规培养组 DC 成熟标志 CD86和 CD83,测定两组 DC －CIK 细胞表型CD3＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋、CD3＋CD4＋;形态观察及 MTT 法分别测定不同效靶比两组 DC －CIK 对A549、H292的杀伤效应;ELISA 法分别检测两组 DC －CIK 上清中 IL －2、IFN －γ、TNF －α分泌水平;流式细胞术分别测定两组 DC －CIK 对肺癌干细胞凋亡的影响。结果：富集培养获得的 EGFR －TKI 耐药肺癌干细胞样细胞高表达干细胞标志物 Sox2和 Oct4,并具较强裸鼠致瘤性。负载膜微粒的 DC 成熟标志 CD86和 CD83较常规 DC 表达显著升高;负载膜微粒的 DC －CIK 较常规 DC －CIK 细胞表型 CD3＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋、CD3＋CD4＋升高,对 EGFR －TKI 耐药肺癌细胞杀伤效应高于常规 DC －CIK,并具有显著提高的靶向趋向性;负载膜微粒的 DC －CIK 分泌因子对 EGFR －TKI 耐药肺癌干细胞样细胞凋亡的影响与常规 DC －CIK 不同。结论：与常规培养 DC －CIK 相比,负载膜微粒的 DC －CIK 活性提高,对 EGFR －TKI 耐药肺癌细胞的体外特异靶向杀伤效应显著提高。细胞分泌因子可显著上调耐药肺癌干细胞的细胞凋亡率。     

负载肿瘤干细胞膜微粒的DC-CIK/CTL细胞协同西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤作用及其机制

目的:探讨负载结直肠癌干细胞膜微粒(membrane microparticles,MMPs)DC-CIK与西妥昔单抗(Cetuximab,C225)对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞的靶向协同杀伤作用及其机制.方法:PCR法检测结直肠癌SW480、SW620、HCT1 16株细胞k-RAS突变状态,无血清悬浮细胞培养法富集SW480、HCT116肿瘤干细胞,RT-PCR检测干细胞标志物Sox-2和Oct-4.提取外周血单个核细胞培养DC与CIK,将结直肠癌干细胞MMPs负载DC后再与CIK共孵育.形态观察及MTT法分别检测DC-CIK/CTL细胞及其培养上清、C225单独和合并处理对SW480、SW620、HCT116及其干细胞的杀伤效应;RT-PCR检测DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独和合并作用对SW480、SW620、HCT116细胞凋亡相关基因Fas和上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关E-钙黏蛋白和波形蛋白基因的表达,划痕实验测定DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独及联合作用对结直肠癌细胞侵袭行为影响.结果:SW480、SW620和HCT116细胞均为k-RAS突变型;富集培养获得的结直肠癌干细胞样细胞高表达Sox-2和Oct-4 mRNA.MMPs负载DC-CIK/CTL细胞及其分泌上清与C225对结直肠癌细胞的抑制有协同作用.C225与MMPs负载DC-CIK/CTL上清联合组相对于两者单独作用组能提高Fas与E-钙黏蛋白基因的表达;联合组的迁移率比两者单独作用组小.结论:负载结直肠癌干细胞MMPs的DC-CIK/CTL细胞对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞有体外特异靶向杀伤效应,且与C225显著协同,其发生机制与逆转细胞EMT和诱导细胞凋亡有关.     

沉默巨噬细胞Wls表达对小鼠肿瘤细胞糖酵解的影响

目的:研究巨噬细胞来源的WNT配体对小鼠肿瘤细胞糖酵解的作用。方法:体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMDMs）,并进行慢病毒感染以沉默其Wntless（Wls）的表达。确定慢病毒沉默效率并利用ELISA法检测WNT3A为代表的配体分泌变化。收集上述不同处理的巨噬细胞条件性培养基用以孵育不同小鼠肿瘤细胞,48 h后检测糖酵解相关分子及经典WNT信号下游靶分子的表达。结果:小鼠原代巨噬细胞慢病毒感染效率较为理想,qPCR检测Wls基因沉默效率达50%以上,符合后续实验要求。ELISA结果显示沉默Wls后的巨噬细胞上清中WNT3A的分泌可得到抑制,与对照组相比可下降50%左右。提取条件性上清孵育后的肿瘤细胞RNA及蛋白样品,qPCR结果提示参与糖酵解的关键酶类在LLC及hepa1-6两种肿瘤细胞中均有下降趋势。并且葡萄糖转运体Glut1以及经典WNT信号下游分子 β-catenin及c-Myc在RNA水平及蛋白水平均有所减少。结论:我们的研究结果初步提示巨噬细胞来源的WNT配体可能通过激活小鼠肿瘤细胞中的经典WNT信号进而参与促进其糖酵解水平。     

EMT 研究进展

上皮细胞间质化（EMT）描述了一种从有极性的不能移动的上皮细胞转化为间质细胞的分子重塑和表型改变,在胚胎发育以及成人的损伤修复、组织再生、器官纤维化等方面发挥重要作用,是肿瘤侵袭、转移和肿瘤耐药发生中的一个重要步骤。现在已经发现多个分子通路、miRNAs 和 EMT 有关,由于 EMT 与肿瘤转移、耐药有重要关系,所以了解 EMT 相关机制对于了解肿瘤的转移和耐药有重要意义。本文现对 EMT相关通路和 miRNAs 作一综述。