PTEN过表达增加人乳腺癌MCF-7细胞对阿霉素的药敏性

目的　研究野生型PTEN体外瞬时转染对人乳腺癌MCF 7细胞的生长抑制作用和对阿霉素敏感性的增效作用。方法　构建带有人全长PTENcDNA的真核表达载体pEGFP C1 PTEN ,以脂质体介导的方法转染MCF 7细胞,观察对细胞生长的抑制作用。以MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果　PTEN使MCF 7细胞出现皱缩变圆,胞质出芽等凋亡形态学改变;流式细胞仪检测显示转染PTEN 4 8hG0 /G1期细胞增加了14 79% ,并出现凋亡峰(10 6 0 % ) ;PTEN显著降低阿霉素处理后的克隆存活率;PTEN转染组细胞对阿霉素的敏感性显著增加(χ2 =8 5 9,P <0 0 5 ) ,其半数致死剂量(IC50 )仅为空载体对照的1/ 2 (t=4 77,P <0 0 1)。结论　PTEN过表达诱导MCF 7细胞凋亡和周期停滞并显著增加对阿霉素杀伤的敏感性     

肿瘤细胞多药耐药与神经酰胺的糖基化

化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一,而肿瘤细胞产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)是临床化疗的最大障碍.MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时,对其他结构不同、作用靶位各异的抗肿瘤药物也产生抗药性.目前对MDR机制的研究较多.近年来,神经酰胺与凋亡的研究日益深入,而糖基化神经酰胺在MDR肿瘤细胞中大量聚集,已经成为MDR表型的标志.神经酰胺糖基化水平的提高是肿瘤细胞MDR的一个新机制.抑制神经酰胺的糖基化,增加细胞内神经酰胺的含量已成为逆转MDR的有效策略.     

肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD3ζ的构建与表达

目的：构建抗肝癌单链抗体融合CD3(真核表达载体。方法：应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3，在5′端及3′端分别引入相应酶切位点；用RT-PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3ζ的胞内区、跨膜区基因，然后将其克隆于scFv的下游，并在5′端及3′端引入相应的酶切位点。以脂质体转染法将pcDNA3-scFv-CD3ζ转入T细胞，采用免疫细胞化学的方法，利用抗CD3(的单克隆抗体检测转染前后T细胞中CD3ζ的表达。结果：二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体ScFv的cDNA片段为735bp，与已知的序列相符；CD3ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为294bp，与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。转染前后T细胞中CD3ζ染色强度显著增强。结论：完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建，制备了肝癌靶向性T细胞。     

鼻咽癌组织中热休克蛋白70表达与EB病毒感染的关系

目的:探讨热休克蛋白70(HSP70)表达与EB病毒潜在膜蛋白蛳1(LMP蛳1)的关系。方法:采用原位杂交和免疫组化技术对41例鼻咽癌(NPC)和24例癌旁组织进行检测。结果:NPC组织中HSP70阳性率为82.9 %(34/41),高于癌旁组织中HSP70的阳性率(54.2 %,P<0.05)。NPC组织中LMP蛳1阳性率为90.2 %(37/41)。37例LMP蛳1阳性的NPC中有33例(89.2 %)HSP70表达阳性,高于LMP蛳1阴性的NPC(25.0 %,P<0.01)。结论:HSP70的高表达可能涉及NPC的发生发展过程,LMP蛳1可以诱导NPC及癌旁组织HSP70的过表达。     

葡萄籽多酚对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR的体内外耐药逆转作用

目的：研究葡萄籽多酚(grape seed polyphenol，GSP)对人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR的体内外耐药逆转作用。方法：采用MTT法检测1．2mg/L和2．4mg/L GSP对MCF-7／ADR的体外耐药逆转倍数。建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，实验分为4组：对照组，GSP组，阿霉素(adriamycin，ADR)组和ADR GSP组，观察GSP对肿瘤细胞的体内耐药逆转作用；采用流式细胞术测定不同用药组P-糖蛋白(Pgp)表达变化。结果：体外1.2mg／LGSP即可有效逆转耐药，2．4mg／LGSP的逆转倍数为9．44；体内裸鼠抑瘤实验显示，GSP有一定抑瘤作用，联用ADR可显著抑制肿瘤生长，20mg/kg GSP可有效逆转CF-7／ADR细胞的耐药性，抑瘤率为54．64％。流式细胞术结果显示，联用GSP与ADR组肿瘤细胞Pgp表达明显低于单独使用ADR组。结论：GSP能在体内外逆转MCF-7／ADR细胞的耐药性，此作用可能是通过抑制Pgp表达实现的。     

Netrin-1在乳腺浸润性导管癌中的表达及与转移的相关性

目的 探讨Netrin-1蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测46例乳腺浸润性导管癌中Netrin-1的表达。结果 46例乳腺浸润性导管癌中30例表达阳性, 16例表达阴性。Netrin-1在有淋巴结转移中的阳性率为78.6%(11/14)。Netrin-1的表达与乳腺癌患者的年龄、原发肿瘤的大小、临床分期及雌激素受体、孕激素受体、Her-2和KI-67的表达无关(P均>0.05), 但与肿瘤的转移有明显的相关性(P<0.05)。结论 乳腺癌患者中存在Netrin-1的异常表达, Netrin-1可能在乳腺癌的发生及转移过程中起到重要作用, Netrin-1可单独作为一个预测乳腺癌转移的指标。     

短发夹状RNA抑制GCS基因在人乳腺癌细胞的表达及逆转其多药耐药

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的短发夹状RNA(shRNA),观察其对人耐药乳腺癌细胞GCS表达的抑制及多药耐药的逆转作用。方法设计2对GCS基因编码的反向重复序列,中间间隔6个nt,体外合成并克隆至载体pSUPER。转染乳腺癌细胞,Westernblot和免疫细胞化学方法测定GCS表达。Westernblot、比色法检测细胞内caspase-3的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率。四氮唑盐(MTT)法检测半数细胞抑制浓度。结果酶切和DNA测序证实重组质粒构建成功。转染后GCS蛋白含量分别下降80%和82%,GCS表达阳性率降低为18·1%和16·7%。caspase-3表达和活性均显著增强,细胞凋亡率明显增加,细胞对化疗药物耐药性有明显下降。结论shRNA可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中GCS表达,并可提高其对多种化疗药物的敏感性。     

人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建

目的克隆正常人T细胞CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,将其与二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的基因克隆入真核表达载体,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定基础,并探讨其对肝癌的杀伤活性。方法应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3,在5'端及3'端分别引入相应酶切位点;用RT-PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,然后将其克隆于scFv的下游,并在5'端及3'端引入相应的酶切位点。结果二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为735bp,与已知的序列相符;CD3ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为294bp,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。结论完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定了实验基础。     

乳腺癌转移相关蛋白蛋白质组学初步研究

目的筛选人乳腺癌腋窝淋巴结转移相关蛋白,并对所筛选的两个差异蛋白进行验证。方法选取有淋巴结转移和无淋巴结转移的乳腺癌新鲜标本各10例,提取组织蛋白进行双向凝胶电泳（2D PAGE）,通过对比分析筛选出差异蛋白点并进行质谱鉴定(MALDI TOF MS)。免疫组织化学SP法检测72例乳腺癌组织中差异表达蛋白Stathmin和Ezrin。结果质谱鉴定出214个蛋白位点。排除胶原蛋白、血清白蛋白及电泳弥散等造成的部分相同蛋白后,筛选出表达差异≥3.0倍的蛋白36个。免疫组织化学检测显示Stathmin、Ezrin蛋白在乳腺癌淋巴结转移组和无淋巴结转移组阳性率分别为73.5%、47.4% 和78.6%、46.9%,两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论淋巴结转移组和无转移组乳腺癌组织存在多种差异蛋白。Stathmin、Ezrin蛋白可能参与了乳腺癌的浸润与转移过程。     

乳腺癌中细胞周期素D1基因改变和转录异常对其蛋白表达的影响

目的:研究乳腺癌中细胞周期素D1(cyclin D1)在DNA、mRNA和蛋白水平的改变,探讨cyclinD1基因改变和转录异常对其蛋白表达的影响.方法:免疫组织化学检测cyclin D1蛋白表达,RT-PCR检测cyclin D1 mRNA的转录异常, southern杂交检测cyclin Dl的基因改变.结果:(1)yclin D1蛋白在乳腺癌中表达阳性率为54%.(2)cyclin D1在早期乳腺癌、浸润性导管癌原发灶、腋窝淋巴结转移灶中表达阳性率的差异无统计学意义.(3)浸润性导管癌中15%出现cydinDl基因扩增,35%出现cyc-lin D1 mRNA表达升高.结论:(1)cyclin D1蛋白表达是乳腺癌发生中的早期事件,且在乳腺癌进程中有稳定保持的趋势.(2)cyclin D1的蛋白表达除受基因扩增和mRNA表达升高的影响外,还受到其他因素的影响.