HPLC法测定灌胃虎杖提取物大鼠粪便及尿液中大黄素和大黄素甲醚

蒽醌类化合物具有消炎、抗菌、致泻、利尿以及抗肿瘤、抗病毒等作用，是大黄、虎杖、何首乌、决明子等中药的主要活性成分。蒽醌类化合物有游离型和结合型两种存在形式。结合型蒽醌不吸收，在肠道内被细菌代谢后产生泻下作用，因此结合型蒽醌在肠道内的吸收、代谢与其药动学有关。已有的药动学研究均为测定血清或血浆中的蒽醌类成分，由于代谢物中成分复杂，干扰较多，因此本实验建立了测定大鼠灌胃虎杖提取物后的粪便和尿液中的游离型和结合型大黄素总量的非水反相液相色谱法。     

非水反相液相色谱法测定三黄片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量

三黄片是一种常用中成药 ,大黄为君药 ,而大黄的主要活性成分为大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等蒽醌类成分。《中华人民共和国药典》2 0 0 0年版采用反相高效液相色谱法测定三黄片中大黄素、大黄酚的含量 ,采用的流动相为甲醇 - 0 .1 %磷酸水溶液 ( 85∶ 1 5 )。其他文献也报道了多种测定蒽醌类成分的方法 ,如薄层色谱法 [1] 、反相高效液相色谱法 [2 ]等 ,最为常用的是反相液相色谱法 ,其流动相均含一定比例的水 ,测定蒽醌类成分所需时间长、峰对称性差、理论板数低。本实验采用非水反相液相色谱法测定三黄片中的大黄酸、大黄素、大…     

功能未知基因C17orf77重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C17orf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法以HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C17orf77目的基因片段,构建pET-32a(+)-C17orf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C17orf77重组蛋白表达并进行Western blot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C17orf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Western blot观察C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系的表达情况。结果 PCR扩增获得C17orf77基因片段,成功诱导表达了C17orf77重组蛋白。制备了多克隆抗-C17orf77,ELISA检测抗体效价1∶1280000。不同浓度C17orf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性(P0.05)。C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C17orf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C17orf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4+T细胞系(Jurkat细胞)均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

高效液相色谱法测定盐酸萘替芬的含量

目的:建立非水反相高效液相色谱法测定盐酸萘替芬的含量.方法:采用Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5μm),乙腈为流动相,流速1.0 mL·min-1,检测波长254nm.结果:盐酸萘替芬在9.7～29.1 mg·L-1浓度范围内与峰面积线性关系良好,r=0.999 9.平均回收率为100.3%,RSD＜0.78%.结论:本方法简便,快速,准确,可用于盐酸萘替芬的快速含量测定.     

糖基转移酶Colgalt2基因敲除对肝细胞再生过程中增殖和凋亡的作用研究

目的初步探讨Colgalt2基因敲除对小鼠肝细胞再生过程中细胞增殖和凋亡的作用。方法根据Higgins和Anderson于1931年提出的肝大部分切除模型,实施Colgalt2+/+野生型对照组小鼠和Colgalt2-/-小鼠(均为C57BL/6J品系)70%肝大部分切除术(PH),分别取正常小鼠和PH后1、3、7天的小鼠再生肝脏的右外叶,于10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片。采用免疫组织化学方法比较细胞增殖核抗原(PCNA)在小鼠肝部分切除术后各时间点组间的表达阳性率差异;胶原酶两步灌注法分别分离正常和PH后1、3、5天的Colgalt2+/+小鼠和Colgalt2-/-小鼠的肝细胞。流式细胞仪检测各组肝细胞凋亡率。结果 PH后1、3、7天,Colgalt2-/-小鼠肝细胞PCNA阳性表达率显著高于Colgalt2+/+小鼠肝细胞PCNA阳性表达率,且差异有显著统计学意义(P0.01)。分离的肝细胞活细胞比率达94%,正常Colgalt2+/+小鼠和Colgalt2-/-小鼠分离的肝细胞凋亡率分别为(23.36±0.83)%、(21.04±1.16)%;PH后1天,Colgalt2+/+对照组小鼠肝细胞凋亡率和Colgalt2-/-小鼠肝细胞凋亡率分别为(8.27±0.33)%、(8.44±0.30)%,PH后1天肝细胞凋亡率均降至最低,随即肝细胞凋亡率逐渐升高;PH后3天,Colgalt2+/+小鼠和Colgalt2-/-小鼠肝细胞凋亡率分别为(15.92±0.56)%、(12.14±0.37)%,Colgalt2-/-小鼠的肝细胞凋亡率明显低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率(P0.01);PH后5天,Colgalt2+/+小鼠和Colgalt2-/-小鼠肝细胞凋亡率分别为(21.36±0.51)%、(18.92±0.92)%,Colgalt2-/-小鼠的肝细胞凋亡率仍低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率(P0.05),肝细胞凋亡率均接近于恢复正常水平。结论糖基转移酶Colgalt2基因敲除在肝再生过程中在一定程度上具有促进肝细胞增殖和抗肝细胞凋亡的作用,提示该基因介导的胶原Glcα1,2Galβ1-糖基化修饰对肝再生可能起着重要的调控作用。     

非水反相液相色谱法测定大鼠虎杖给药后血浆中大黄素、大黄素甲醚的含量

目的:采用非水反相液相色谱法测定大鼠血浆中大黄素、大黄素甲醚的含量.方法:血浆经水解、提取后用非水反相高效液相色谱法分析其含量,采用Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm),甲醇-冰醋酸(99.9:0.1)为流动相;流速为1.0mL·min-1;检测波长254nm.结果:大黄素在0.0425～2.8μg·mL-1、大黄素甲醚在0.0491～3.14μg·mL-1范围内线性关系良好;大黄素、大黄素甲醚的回收率分别为95.7%～100.1%,96.2%～99.8%,RSD分别为1.3%,1.6%;提取回收率分别为91.8%～95.4%、92.7%～94.6%.结论:本方法准确、简便,重现性好,适宜于测定含大黄素、大黄素甲醚的生物样品.     

反相高效液相色谱法测定人血浆中阿替洛尔的浓度

目的:建立反相高效液相色谱法测定血浆中阿替洛尔浓度.方法:以乙酸乙酯-异丙醇(8:1)为提取溶剂,液-液萃取法处理血浆样品.色谱柱:Phenomenex C18;流动相:0.05 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(pH 3.2)-乙腈(90:10).检测波长:λex=230 nm,λem=310 nm.流速:1.0ml·min-1.结果:线性范围4.6～883.2 ng·ml-1;最低检测浓度为2.3 ng·ml-1;绝对回收率为95.1%;日内RSD小于3.9%,日间RSD小于5.5%.结论:方法灵敏准确,简便可行,适于阿替洛尔的治疗药物浓度监测.     

非水反相液相色谱法测定三黄片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量

三黄片是一种常用中成药 ,大黄为君药 ,而大黄的主要活性成分为大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等蒽醌类成分。《中华人民共和国药典》2 0 0 0年版采用反相高效液相色谱法测定三黄片中大黄素、大黄酚的含量 ,采用的流动相为甲醇 - 0 .1 %磷酸水溶液 ( 85∶ 1 5 )。其他文献也报道了多种测定蒽醌类成分的方法 ,如薄层色谱法 [1] 、反相高效液相色谱法 [2 ]等 ,最为常用的是反相液相色谱法 ,其流动相均含一定比例的水 ,测定蒽醌类成分所需时间长、峰对称性差、理论板数低。本实验采用非水反相液相色谱法测定三黄片中的大黄酸、大黄素、大…     

GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程相关性分析

目的 探讨GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程的相关性.方法 通过抗原表位预测软件BepiPred 1.0Server将GLT25D1基因片段分为GLT25D 1-1和GLT25D 1-2两部分,PCR扩增获得目的片段,构建其原核表达质粒；对制备的多克隆抗体进行效价及特异性分析.通过以GLT25D1为抗原的ELISA双抗体夹心的方法,检测其在HBV感染不同阶段的患者的血清水平.结果 成功表达重组蛋白,Western blot鉴定正确；成功制备兔抗人(GLT25D1-1、GLT25D 1-2)的多克隆抗体,效价较高,特异性良好.通过ELISA方法检测HBV感染患者血清,慢性乙肝(病理结果不超过S3期)、肝硬化(S3-4期及S4期)以及肝癌患者中GLT25D1的OD值较正常组均有显著性差异(P＜0.01).结论 通过血清学检测结果,我们发现GTL25D1存在于HBV感染的肝病的各进程中,进而我们推测血清GLT25D1可能会作为检测肝纤维化进程的一个新的血清学指标.     

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.