过表达Wnt3基因抑制肝前体细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺
病毒载体（Ad-Wnt3）转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组（Ad-GFP）为对照。转染72 h 后,用荧光显微镜观察
Hoechst33342 染色后细胞凋亡情况;流式细胞术检测Annexin-PE/7-ADD法标记的细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别检
测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平。结果qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3在肝前体
细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3能高效转染肝前体细胞。与对照组相比较,肝前体细胞转染Wnt3后,肝前体细胞的
凋亡水平明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。Bax的mRNA及蛋白表达水平
则明显下降（P<0.05）。结论在肝前体细胞中,Wnt3基因过表达能抑制肝前体细胞凋亡,其机制可能是通过Bcl-2家族起作用。     

虫草素通过抑制NF-κB途径增强A549细胞对顺铂的敏感性

 目的 通过研究虫草素和顺铂单用或联用对肺癌细胞A549的抗肿瘤效应,探讨其可能的作用机制,为临床肿瘤治疗提供新思路。方法 四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的虫草素与顺铂单用或虫草素与顺铂(3 μg·mL^-1)联用对A549的增殖抑制作用,并计算IC₅₀;采用Hoechst 33258染色法及流式细胞术检测虫草素与顺铂单用或联用诱导A549细胞凋亡情况;Western blot法检测不同处理组的细胞核内NF-κBp65及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平。结果 虫草素与顺铂联用对A549细胞的抑制作用显著增加,增强了顺铂对A549的敏感性; Hoechst 33258染色及流式细胞术显示,与虫草素和顺铂单独用药相比,联合用药能够明显增加顺铂诱导的细胞凋亡;Western blot结果显示,与对照组相比顺铂能够增加细胞核内NF-κBp65的活性,然而虫草素却能抑制NF-κBp65的活性,联合用药后NF-κBp65的活性明显下调;与顺铂单独用药相比,联合用药组能够使促凋亡蛋白Bax表达显著增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则降低。结论 虫草素能够增强顺铂对肺癌细胞A549的敏感性,其作用机制是通过抑制NF-κB途径,调节下游信号分子 Bax和Bcl-2的表达而实现。     

稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响

目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catemn信号通路的影响.方法 重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组.MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达.结果 RT-PCR和Western blot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P＜0.05);G1细胞比例明显减少(P＜0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P＜0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P ＜0.05); GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P＞0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05).结论 成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖.     

Wnt3诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化

目的 探讨wnt3对小鼠肝前体细胞(14-19)发生上皮-间质转化的影响。方法 分别将空载体Ad-GFP和表达wnt3的腺病毒Ad-GFP-wnt3转入小鼠肝前体细胞中,显微镜下观察细胞形态变化。细胞划痕实验和细胞迁移实验观察14-19细胞迁移能力。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析分别检测14-19细胞中上皮标记物和间质标记物的表达改变。结果 显微镜下可见高表达wnt3的14-19细胞由不规则多边形变为长梭形。细胞划痕实验和细胞迁移实验结果显示,高表达wnt3的14-19细胞迁移能力明显提高,与空载体转染细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。　实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,间质标记物N-cadherin、vimentin和twist1的mRNA和蛋白水平表达上调,相反上皮标记物E-cadherin的mRNA水平和蛋白水平表达下调,　与空载体转染细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 Wnt3能够促使小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化,提示其可能参与了肝纤维化的发展进程。     

HBx诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化

目的 探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)能否诱导肝前体细胞(HPCs)发生上皮-间质转化(EMT).方法 将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,经稻瘟菌素(blasticidin)筛选,获得稳定表达HBx的HP14.5细胞.观察其形态变化,通过实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot法检测其间质细胞标志物和上皮标志物在mRNA和蛋白水平的表达量,并采用划痕实验检测其细胞迁移能力的变化.结果 HP14.5细胞稳定表达HBx蛋白后细胞由多角形变为长梭形;与对照组相比,神经钙黏素(N-cadherin)、Snail、vimentin的mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(P＜0.05)而上皮性钙黏素(E-cadherin)、细胞角蛋白18(CK18)的mRNA和蛋白表达量显著降低(P＜0.05;同时其迁移能力显著升高(P＜0.05).结论 HBx能诱导肝前体细胞发生EMT,并增强其迁移能力.