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目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析(NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG)以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。 相似文献
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甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1与人CPSF30结合拮抗剂筛选模型的建立及药物筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
利用酵母双杂交技术研究甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异因子30 kDa 亚基 (CPSF30) 的相互作用, 构建了一个酵母模型用于筛选NS1和CPSF30相互作用的拮抗剂, 从而为筛选抗甲型H1N1流感病毒药物奠定基础。采用连续重叠PCR技术克隆得到H1N1流感病毒NS1基因。提取人HeLa细胞RNA, 通过RT-PCR克隆得到人CPSF30基因。将NS1基因克隆到表达载体pGBKT7中获得诱饵载体pGBKNS1, 将CPSF30基因克隆到载体pGADT7中获得捕获载体pGADCPSF; 将pGBKNS1和pGADCPSF共转入酿酒酵母AH109, 获得重组酿酒酵母AH109[pGADCPSF+pGBKNS1]。利用该模型筛选了30余种中成药, 发现双黄连口服液等4种中成药能抑制NS1和CPSF30之间的相互作用。 相似文献
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磷酸二酯酶4研究进展 总被引:2,自引:3,他引:2
环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)对于细胞的许多功能有重要作用。磷酸二酯酶(PDEs)催化cAMP和cGMP水解开环分别生成AMP和GMP,这是细胞内降解cAMP和cGMP的唯一途径。PDEs可分为11个家族,其中有8个家族可以水解cAMP,包括能专一性地水解cAMP的PDE家族(如PDE4),和既可水解cAMP又可水解cGMP的PDE家族。PDE4同工酶主要存于在炎症细胞中。PDE4可分为A、B、C、D 4个亚家族,根据其N端的特殊结构,有长、短和超短三种形式。PDE4催化区三维结构的阐明有助于它们功能的研究和相关药物的设计。PDE4通过与其它蛋白如抑制蛋白、A激-酶锚定蛋白(AKAP)以及活化的C激酶1受体(RACK1)等相互作用使cAMP浓度区域化,选择性地调节各种细胞功能。PDE4作为一个治疗靶点,研究其选择性抑制剂具有重要的意义,可以用于治疗由炎症引起的疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、阿尔采末病(AD)、帕金森病(PD)和中风等由潜在的炎症引起神经元受损造成的中枢神经系统疾病。 相似文献
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目前 ,生命科学的各个领域已深入到分子生物学水平 ,在将外源基因向质粒载体的克隆过程中 ,常规方法操作的步骤繁琐 ,花费时间长 ,若忽略一些细小因素可导致克隆失败。本实验室在长期的分子克隆工作中 ,积累了一些经验 ,建立了一种快速连接及筛选重组阳性克隆的简便方法。我们以紫杉烯合酶 (taxadienesynthase ,TS)基因向真核表达载体pIGF2中的克隆为例 ,报告如下 ,以供在条件简易情况下的工作者参考使用。1 材料与方法1.1 材料真核表达载体pIGF2由英国Norwich食品研究所Jeenes博士赠送的 pIGF质粒衍生而来。限制性内切酶购于中国协… 相似文献
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中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA克隆(简报) 总被引:1,自引:0,他引:1
紫杉烯合成酶(taxadiene synthase)是抗癌药物紫杉醇生物合成途径的第一个酶,也是关键酶,在红豆杉植物体内催化生成紫杉醇的母核--紫杉烯;它在植物体内低水平的表达和低酶活力被认为是紫杉醇在植物体内含量低微的重要因素.Wildung等已经得到了太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)紫杉烯合成酶的cDNA及其核苷酸顺序,长度为2 700 bp,开放阅读框架为2 586 bp,其中包括编码137个氨基酸残基的质体转移肽和725个氨基酸残基的紫杉烯合成酶肽链.我们过去的研究得到一中国红豆杉(T.chinensis)高产紫杉烷类化合物的愈伤组织细胞系,并构建了它的cDNA文库,克隆载体为λgt10. 相似文献