地黄全长转录组测序及苯乙醇苷合成途径催化酶基因鉴定

地黄为玄参科药用植物,具有重要的药用价值。为了有效发掘地黄的转录组信息,鉴定参与苯乙醇苷(PhGs)类成分生物合成的催化酶基因,本研究以地黄的叶、茎和块根为材料利用Pacific Biosiences RS Ⅱ平台进行测序。共获得非冗余的转录本27 773条,平均长度2 380 bp,预测出27 236个蛋白编码序列(CDS:coding sequence)。利用BLAST等软件在NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro等数据库共预测到27 399个注释的基因。NR注释表明,与地黄转录本匹配数量最多的是芝麻(Sesamum indicum),有81.44%,这与它们进化上的亲缘关系一致。推测了参与异毛蕊花糖苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷F、2′-乙酰毛蕊花糖苷和leonoside F生物合成的催化酶,并鉴定出143个参与苯乙醇苷类成分生物合成的转录本。19个催化酶基因在地黄12个组织中与毛蕊花糖苷的含量呈正相关,其中多数基因在叶和花中具有较高的表达量。研究结果为地黄功能基因的挖掘提供了可靠的转录组数据,为苯乙醇苷类成分生物合成的分子机制研究提供了依据...     

不同种质地黄块根菊花心表型性状及HPLC指纹图谱特征分析

目的:探讨不同种质地黄块根菊花心表型性状及高效液相(HPLC)指纹图谱特征。方法:观察测量地黄整个生育期内菊花心形状及比例直径的变化,同时建立表征地黄块根、菊花心及非菊花心部位化学质量的HPLC指纹图谱,并采用主成分和系统性聚类方法对其进行分析。结果:不同种质地黄的菊花心形状及大小存在明显差异且具有一定的规律性;指纹图谱显示不同种质地黄不同部位的化学成分种类具有一致性,其化学质量特征的差异主要在于化学成分含量及其相对比例的不同;主成分分析结果表明毛蕊花糖苷、梓醇、益母草苷、地黄苷A和地黄苷D等有效成分基本均参与了各种质地黄不同部位的质量表达,但每种成分在各种质地黄不同部位之间质量差异表达中的贡献率不同,同时参与这种差异表达的其他成分在各种质地黄中的贡献率也不同;系统性聚类分析表明,北京1号,沁怀,1706及沁怀郑地黄的菊花心与非菊花心化学质量特征差异较大,而85-5,白选地黄的菊花心与非菊花心部位化学质量特征差异较小。结论:不同种质地黄菊花心表型性状及其HPLC指纹图谱特征具有一定的差异。     

地黄高效叶片离体再生系统的建立△

目的:通过分析不同浓度激素对地黄品种金九的愈伤诱导、再生芽分化等方面的影响,以期建立高效的地黄叶片再生系统,为地黄的快速繁殖和遗传转化研究奠定基础。方法:分析在添加不同浓度NAA、6-BA情况下地黄叶片的愈伤诱导率、再生芽分化率、再生芽生根率和增殖系数。结果:在多个激素浓度组合下均具有较高的叶片愈伤诱导率。最适于金九的叶片再生芽分化的激素浓度为NAA0.1mg·L-1、6-BA2.0mg·L-1。在适宜的激素浓度范围内,金九的再生芽分化率很高,最高可达96.67%。添加0.1mg·L-1的NAA有利于再生地黄植株壮苗和提高生根率。在含有NAA0.1mg·L-1、6-BA0.5mg·L-1的MS培养基上培养,则有利于再生芽的增殖。结论:NAA、6-BA的浓度对叶片再生芽分化、生根和增殖有显著影响。金九可作为地黄的分子生物学研究和遗传转化受体的良好材料。     

盾叶薯蓣须根响应低磷胁迫的GC-MS代谢产物及基因表达特征分析

目的 探讨盾叶薯蓣须根在低磷胁迫下的代谢产物及基因表达特征。方法 设置重度胁迫组、中度胁迫组与正常组模拟盾叶薯蓣低磷胁迫实验,在胁迫初期采取盾叶薯蓣须根,分别利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）衍生化及RNA-seq技术对其代谢产物和转录组特征进行分析,通过对不同处理代谢产物的多元统计分析、差异表达基因的功能分析及数据挖掘,筛选低磷胁迫下盾叶薯蓣须根产生的代谢标志物,分析差异表达基因的代谢通路特征。结果 从盾叶薯蓣须根中共检测到116个GC-MS代谢产物,不同低磷处理下盾叶薯蓣须根的代谢特征存在明显差异,利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型从不同处理须根的代谢产物中筛选到6个差异代谢物,主要为糖类、醇类等成分,这些物质可能是盾叶薯蓣须根响应低磷胁迫的代谢标志物;重度胁迫组与正常组中筛选到的差异基因主要富集到过氧化物酶途径、磷酸盐和次磷酸盐代谢途径,重度胁迫组与中度胁迫组中筛选到的差异基因主要富集到谷胱甘肽代谢途径及磷酸戊糖途径;从须根中筛选出177个潜在响应低磷胁迫的差异基因,涉及萜类骨架、肌醇生物合成等多个途径,这与盾叶薯蓣须根部位响应低磷胁迫的代谢差异物多为糖类与肌醇等物质相吻合。结论 低磷胁迫下盾叶薯蓣须根部位的代谢产物及基因表达均发生了相应的应答,差异代谢物与差异表达基因具有密切的关系,该研究为盾叶薯蓣响应低磷胁迫的分子机制提供理论依据。     

地黄毛蕊花糖苷合酶基因的克隆、亚细胞定位与表达特性分析

目的克隆地黄Rehmanniaglutinosa毛蕊花糖苷合酶基因(Rg Ac S1),分析其亚细胞定位和表达模式。方法在地黄的转录组数据库中通过注释和比对,获得地黄Rg Ac S1的c DNA序列,利用聚合酶链式反应(PCR)方法进行分子克隆。构建绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,以农杆菌瞬时表达法观测Rg Ac S1的亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Rg Ac S1基因在地黄块根不同部位的表达模式。结果获得地黄1个莽草酸-O-羟基肉桂酰基转移酶的全长编码序列,c DNA长度为1 659 bp,包含1个1 296 bp的开放阅读框,编码431个氨基酸残基,蛋白质相对分子质量为475 900,具有莽草酸-O-羟基肉桂酰基转移酶的典型结构域,命名为Rg Ac S1。亚细胞定位结果显示Rg Ac S1主要分布在细胞质中,在细胞核中也有分布。q RT-PCR分析表明,Rg Ac S1在地黄的周皮和根毛中表达量较高,在木质部和韧皮部表达量较低。Rg Ac S1基因在地黄品种北京1号、QH1和85-5中非菊花心中表达量均高于菊花心中的表达量,且差异达极显著水平。结论获得地黄Rg Ac S1的c DNA序列,明确了Rg Ac S1的亚细胞定位和时空表达模式,为进一步研究Rg Ac S1基因在毛蕊花糖苷合成过程中的作用奠定基础。     

不同种质地黄块根菊花心与非菊花心部位有效成分特征分析

目的:比较沁怀,85-5,北京1号,QH-1,1706,白选6种地黄生育期内菊花心与非菊花心中梓醇,毛蕊花糖苷,地黄苷A,D,益母草苷,多糖等指标性成分的含量,分析不同地黄种质资源菊花心的成分差异及质量特征,为地黄的质量评价及道地性揭示提供科学依据。方法:梓醇、毛蕊花糖苷含量测定参考2015年版《中国药典》;地黄苷A,D及益母草苷含量测定采用HPLC法,Dikma Diamonsil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(4∶96),流速1 mL·min~(-1),检测波长205 nm,柱温30℃,进样量20μL;多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。结果:不同种质地黄块根各指标性成分在菊花心与非菊花心部位富集量差异很大。85-5与1706地黄菊花心部位中梓醇含量远高于非菊花心部位,而北京1号与QH-1地黄则是非菊花心部位明显高于菊花心部位;85-5,1706及QH-1地黄中毛蕊花糖苷在菊花心部位中的含量明显高于非菊花心部位,其他3个种质分布相对均匀;沁怀和北京1号地黄块根非菊花心部位中地黄苷A的含量明显高于菊花心部位;85-5,北京1号,1706地黄块根非菊花心部位中地黄苷D的含量均明显高于菊花心中的含量,其他种质差异不大;85-5,白选和1706地黄菊花心与非菊花心部位益母草苷含量差异不大,而北京1号,沁怀,QH-1地黄则为菊花心部位远高于非菊花心部位,差异达2~4倍;6种地黄块根非菊花心部位中的多糖含量明显高于菊花心部位。结论:种质在一定程度上决定了地黄块根次生代谢产物在地黄菊花心与非菊花心部位的积累与分布。     

盾叶薯蓣WRKY转录因子的鉴定和生物信息学分析

目的鉴定盾叶薯蓣WRKY(DzWRKY)转录因子家族基因,分析DzWRKY蛋白的序列特征,检测DzWRKY在根和叶中的表达量。方法以拟南芥WRKY基因的c DNA为查询序列,应用BLASTn进行比对,应用生物信息学方法进行全长开放阅读框(ORF)预测和蛋白序列特征分析,根据转录组数据检测DzWRKY的表达量。结果共检测到27个具有全长ORF的DzWRKY家族基因,其中6个基因编码的蛋白具有2个WRKY结构域。DzWRKY蛋白均为亲水性蛋白,亚细胞预测为核蛋白,WRKY结构域序列保守程度高。进化分析均把27个DzWRKY蛋白和19个At WRKY蛋白分为3个大类群。27个DzWRKY在叶片中的表达量均比根茎低,高表达的DzWRKY基因主要集中在第I类和第IId亚类。盾叶薯蓣WRKY与已知功能的WRKY序列相似性较低。结论首次从盾叶薯蓣中鉴定出DzWRKY基因,为进一步阐明DzWRKY在盾叶薯蓣生长发育和药效成分代谢中的作用奠定基础。     

怀地黄块根中菊花心与非菊花心部位的化学质量特征比较

利用HPLC对怀地黄"北京1号"生育期内块根中菊花心、非菊花心及整体块根三部位中梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷进行含量测定,并结合其HPLC指纹图谱进行整体化学质量特征比较。结果表明,生育期内怀地黄主要成分含量变化趋势不同;各成分在菊花心与非菊花心部位富集量差别较大。梓醇、毛蕊花糖苷与地黄苷D在菊花心与非菊花心中的分布相对均匀,非菊花心部位地黄苷A的含量明显高于菊花心部位,而菊花心部位益母草苷的含量则明显高于非菊花心部位;地黄菊花心、非菊花心及整体块根3部位的HPLC指纹图谱色谱行为基本一致,但是化学成分含量相差较大;通过聚类分析,怀地黄菊花心部位与非菊花心部位、整体块根明显被分为2类。因此,怀地黄菊花心与非菊花心部位化学质量特征存在明显差异。该研究为怀地黄的质量评价和道地性的揭示提供依据。     

地黄生长过程中根际土壤挥发性有机物与细菌群落特征分析

目的 分析地黄生长过程中根际土壤挥发性有机物（VOCs）、细菌群落特征的变化，以及VOCs与细菌群落结构的关系，为地黄连作土壤形成过程中的特征评价及连作土壤微生物的调控研究奠定基础。方法 以地黄7月、8月、10月3个主要生长时期的根际土壤为研究对象，采用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定根际土壤乙酸乙酯部位及二氯甲烷部位中VOCs的相对含量，运用高通量测序法测定其根际细菌群落结构特征，利用SPSS 24、SIMCA 14.1等分析3个时期根际土壤VOCs、细菌群落结构的差异性，筛选引起其差异的主要VOCs和标志性菌群，并分析VOCs与细菌群落结构的相关性。结果 地黄3个生长时期根际土壤不同部位中的VOCs存在差异，其中乙酸乙酯部位的VOCs差异物质有间苯二甲酸二辛酯、2-辛基-1-十二烷醇、对甲苯甲酸-2-乙基己酯，二氯甲烷部位的则包括间苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、邻苯二甲酸二（2-丙基戊基）酯、对甲苯甲酸-2-乙基己基酯。地黄从苗期到块根膨大末期，其根际土壤中放线菌门、厚壁菌门和绿弯菌门等优势菌门的相对丰度逐渐降低，而且各生长时期的根际土壤均有可以表征自己特有的细菌群落。相关性分析表明，地黄根际土壤VOCs对根际细菌群落结构有影响，其中以酯类、醇类等成分对根际细菌群落结构的影响较大。结论 在地黄的生长过程中，根际土壤的特征表现为酯类和醇类等主要VOCs含量发生变化和主要有益菌群相对丰度的逐渐降低，而且根际土壤VOCs对细菌群落结构的塑造有一定作用。     

不同品种地黄中毛蕊花糖苷的动态积累规律变化

目的:对大田生长期间不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量进行测定,研究道地产区不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷的积累规律。方法:以栽培地黄85-5,北京1号,沁怀,金九和白选为材料,于2015年和2016年在河南温县大田栽培,以HPLC检测不同采收期不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷的含量。并以85-5为材料,于2014年进行遮阴处理,以HPLC检测遮阴后地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量。结果:不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷含量有较大差异,块根中毛蕊花糖苷含量较高的2个品种是白选和沁怀,两年内毛蕊花糖苷含量变化分别为0.023%~0.620%和0.018%~0.796%;叶片中毛蕊花糖苷含量较高的品种为85-5和北京1号,毛蕊花糖苷含量变化分别为1.955%~5.968%和0.681%~5.941%。不同发育阶段的地黄叶片中,展开叶和衰老叶较幼嫩叶含有较高的毛蕊花糖苷。遮阴对地黄块根中毛蕊花糖苷含量有促进作用,对叶片中毛蕊花糖苷含量有抑制效应。结论:该研究为毛蕊花糖苷高含量地黄新品种的选育提供实验材料和依据,同时也为明确地黄毛蕊花糖苷积累变化的分子机制奠定基础。