佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立

目的 建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法，为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法 基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析，筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列，并以人GAPDH基因为内参照，设计引物、探针，采用L₉(3⁴)正交实验确定最佳反应条件，建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法，并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品，制作标准曲线，建立绝对定量方法。结果 经系统优化，建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法，反应体系包括：基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针，RT/Taq酶混合液，反应缓冲液及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株，亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果，而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应，检测下限为580拷贝/mL。定量分析表明，在5.80×10²～5.80×10^10<...     

九香止泻方喷雾和减压干燥品中有效成分比较

目的 比较喷雾干燥法与减压干燥法制得的九香止泻干浸膏粉有效成分量的差异,为确定九香止泻浓缩液（或稠浸膏）合理的干燥方法提供依据。方法 采用HPLC法测定喷雾干燥与减压干燥法制成的九香止泻干浸膏粉中秦皮甲素、秦皮乙素,采用络合滴定法测定总鞣质。结果 九香止泻方减压干燥后秦皮甲素量高于喷雾干燥,减压干燥与喷雾干燥后秦皮乙素、总鞣质的量差异无统计学意义,两种干燥方法皆适用。结论 综合考虑各有效成分量的差异,减压干燥优于喷雾干燥。     

湿疹贴膏剂中冰片、薄荷脑包合工艺探讨

目的 优选湿疹贴膏剂中冰片、薄荷脑包合的最优工艺参数.方法 以冰片、薄荷脑为评价工艺指标,气相色谱法测定两者的含量.用研磨法进行包合,正交设计实验筛选最佳工艺参数.结果 β-环糊精加2倍水量,研磨时间1.0 h,35℃下干燥制备的包合物中冰片、薄荷脑的包合量、含量均最高.结论 该条件为制备湿疹贴膏剂冰片、薄荷脑β-环糊精包合物的最佳工艺参数.     

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法。方法在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板。随后设计检测用PCR引物,并于引物5′端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化。结果初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上。结论PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法。     

关于RAPD技术中几个条件的探讨

本文通过对RAPD技术反应中模板抽提，模板浓度，Mg^2 和dNTP浓度，样本选择取大小的分析，探讨了RAPD的反应条件，高纯度的模板DNA是反应进行的基础，模板的用量一般在25－100ng为佳；对每一引物，模板都应反复摸索，以获得最佳Mg^2 与dNTP浓度；群体扩增产物出现的多样性比个体的更为丰富明显；取样大小对结果的统计分析影响不大。只有在充分优化RAPD反应条件的基础上，才能够得到准确的结果。     

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

登革病毒1～4型（dengue virus type 1-4，DV1-4）、流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）及黄热病病毒（yellow fever virus，YFV）均为黄病毒属的重要传染病病原，其流行季节及临床症状都极为相似，且暴发日益频繁，发展特异、敏感的快速诊断及鉴别诊断方法，对这类疾病的预防及控制具有重要意义。本研究在对其基因组序列系统分析的基础上，建立了快速检测及鉴别诊断上述病毒的微孔杂交（PCR-ELISA）方法。     

旋毛虫新生幼虫期特异性基因丝氨酸蛋白酶的结构预测与功能分析

我国旋毛虫病患者数及死亡率居三大食源性人兽共患寄生虫病之首[1 ] 。旋毛虫新生幼虫肠型期 (NBL )为非细胞内寄生并在血液中移行 ,对宿主的免疫作用较敏感。利用基因工程技术制备 NBL抗原用于旋毛虫病的诊断和预防具有重要意义。本文对旋毛虫新生幼虫 c DNA文库进行筛选 ,获得其特异性全长基因 ,采用生物信息学原理对其进行分析 ,结果报告如下。1　材料与方法1.1　材料　 NBL特异性全长 c DNA (编号 :SSC2 ) :由 NBL特异性探针从其 c DNA文库调取。克隆入 λZAP载体 ,由解放军军需大学动科系刘明远博士提供 [2 ]。1.2　基因片…     

疏水性区域及稀有密码子对登革2型病毒E基因原核表达影响的分析

登革病毒E蛋白是病毒主要毒力蛋白,带有型特异及属特异抗原决定簇,既能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体,与登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的致病机制有关[1].有学者已经利用包括大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞等多种表达系统对其表达条件进行了探讨,由于受未知因素的影响,登革病毒E蛋白的原核重组表达一直不理想[2～4].本研究对登革病毒E蛋白不同区域的原核表达进行了较为系统的分析,探讨疏水性区域及稀有密码子登革病毒E蛋白表达的影响,并对部分区域进行了高效原核表达.广东省科技计划项目(20006836008005);全军医药卫生科研基金资助课题(06MA129)     

微孔杂交检测登革病毒及其分型方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒检测及分型方法：方法分析登革1～4型病毒基因组序列，分别设计针对登革病毒1～4型的特异性包被探针，扩增、克隆测序后包被聚乙烯微孔板。PCR上游引物5’端标记生物素，对待检样品进行扩增后用作检测探针进行微孔杂交（PC艮ELISA）反应，并通过设定不同的包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间．对PCR—ELISA反应进行优化：结果建立了快速，特异、敏感的登革病毒快速检测及分型方法．试验结果直观，阳性标本吸光度值存0．5以上，阴性结果吸光度值在0．1以下，S/N值在10以上。结论所建立的方法可用作登革病毒感染的早期诊断及分型。