补肾中药骨灵丸对成骨细胞矿化功能及骨桥蛋白基因表达的影响

目的探讨含补肾中药-骨灵丸大鼠血清对体外培养成骨细胞(OB)矿化功能及骨桥蛋白基因表达的影响。方法取SD乳鼠颅骨,采用改良胰酶-胶原酶消化法分离培养;根据血清药理学的方法制备含不同剂量(高、中、低剂量)骨灵丸血清,并以空白组(灌喂生理盐水)为阴性对照、雌二醇(E2,10-8 mol／L)组为阳性对照;将制备好的各组血清分别加入第二代OB的培养液中进行培养,采用Westem-blot及RT-PCR的方法观察补肾中药血清对OB骨桥蛋白及基因表达的影响,利用茜素红染色方法测定矿化结节形成的数量。结果含骨灵丸(中、高剂量组)血清均能上调OB骨桥蛋白及基因的表达,使钙结节的数目增加,与空白对照组相比较具有统计学意义(P<0．05);空白对照组及补肾中药低剂量组对骨桥蛋白表达及矿化结节的形成无影响。结论骨灵丸可上调骨桥蛋白基因的表达,这可能是骨灵丸促进钙结节形成、影响骨代谢的机理之一。     

乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白对大鼠佐剂型关节炎滑膜细胞因子的作用

目的:观察乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白(tyPe Ⅱ collagen,CⅡ)对大鼠佐剂型关节炎(adjuvant arthritis,AA)滑膜细胞因子的作用.方法:限制性胃蛋白酶降解法提取乌梢蛇CⅡ,SDS-PAGE凝胶电泳法和紫外分光光度计法鉴定;采用完全弗氏佐剂(complete Freud′s adjuvant,CFA)足垫皮下注射诱导AA大鼠模型;收集滑膜细胞上清液,L929细胞毒性法检测滑膜细胞上清液中TNF-α生物活性,MTT法检测滑膜细胞上清液中IL-1β生物活性;ELISA法检测滑膜细胞上清液细胞因子水平.结果:提取的CⅡ分子量约为118kD～120 kD,紫外光谱吸收仪测定提取的CⅡ吸收峰为230nm,均与标准的牛鼻中隔CⅡ相符;乌梢蛇CⅡ各剂量组体外对滑膜细胞上清液TNF-α和IL-1β活性没有直接作用;乌梢蛇CⅡ中剂量组可抑制AA大鼠的滑膜细胞和派氏淋巴结共培体系上清液TNF-α和IL-1β活性(P＜0.01),乌梢蛇CⅡ低、高剂量可抑制AA大鼠的滑膜细胞和派氏淋巴结(PP)共培体系上清液IL-1β活性(P＜0.05);灌服乌梢蛇CⅡ低、中剂量组与模型组比较,TNF-α活性下降(P＜0.05);中剂量组与模型组比较,IL-1β活性下降(P＜0.05);模型组与空白对照组比较,滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平显著升高(P＜0.01);乌梢蛇CⅡ中、高剂量组与模型组比较,均能抑制滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平(P＜0.01);乌梢蛇CⅡ低剂量组能显著抑制滑膜上清液IL-1β水平(P＜0.01);乌梢蛇CⅡ中剂量能显著升高滑膜上清液TGF-β(P＜0.01);结论:乌梢蛇CⅡ体外对滑膜细胞炎症因子无直接作用,灌服乌梢蛇CⅡ可以抑制滑膜细胞炎症因子的水平和活性.     

乌梢蛇蛋白对滑膜细胞增殖、凋亡及wt-p53/bcl-2 mRNA表达的影响

目的研究乌梢蛇蛋白对体外培养的类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)生长的抑制情况,探讨乌梢蛇蛋白影响FLS凋亡的可能分子机制。方法常规方法提取乌梢蛇总蛋白,组织贴块法培养FLS;采用不同剂量(高、中、低剂量)乌梢蛇蛋白作用FLS后,应用MTT法检测乌梢蛇蛋白对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞的凋亡情况,RT-PCR方法检测细胞wt-p53/bcl-2mRNA的变化。结果乌梢蛇蛋白中高剂量组FLS增殖率与空白对照组比较明显减少,细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01);乌梢蛇蛋白中高剂量组FLS的wt-p53mRNA表达量增加,Bcl-2mRNA表达量降低,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论乌梢蛇蛋白可抑制FLS增殖和促进其凋亡,其作用机制可能是通过调节wt-p53/bcl-2基因表达来实现。     

水溶性乌梢蛇总蛋白的提取方法及细胞毒性检测

背景:寻找分析乌梢蛇的具体活性成分,需对乌梢蛇总蛋白进行提取和分析,但目前有关乌梢蛇蛋白的提取方法甚少.目的:建立提取水溶性乌梢蛇总蛋白的方法,检验水溶性乌梢蛇总蛋白体外细胞毒性.方法:应用酶裂解与盐析相结合的方法提取乌梢蛇总蛋白,采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测盐析前后所得的蛋白浓度,使用SDS-PAGE分离蛋白,应用图像分析软件分析Quantity One 4.4比较分析其区带差异.分别用盐析后所得的不同浓度的蛋8(0.5,5,50,150,450和900 mg/L)和蛋白提取液作用于成纤维样滑膜细胞,四甲基偶氮唑蓝法测定各组成纤维样滑膜细胞增殖率.结果与结论:水溶性总蛋白浓度与盐析总蚩白浓度比较差异无显著性意义(P＞0.05);两种方法所提取的水溶性乌梢蛇总蛋白差异无显著性;提取液组和盐析后所得的蛋白质的150和450 mg/L组均可以抑制成纤维样滑膜细胞的增殖;而空白对照组和酶裂解与盐析后所得蛋白的0.5,5和50 mg/L对细胞的增殖作用无影响.提示酶裂解和盐析结合的方法可提取高质量低毒的水溶性乌梢蛇总蛋白,所提取蛋白包含了乌梢蛇的特征性蛋白,适合于体外细胞模型的研究.     

喂饲补肾中药大鼠的血清对成骨细胞的生物学作用

目的 探讨喂饲补肾中药大鼠的血清对体外培养的成骨细胞的生物学作用。方法 在新生SD大鼠头颅骨第2代成骨细胞培养液中加入不同浓度(低、中、高)的中药血清，并与空白组对照，分别观察成骨细胞的增殖、分化和矿化功能。结果 补肾中药血清具有刺激成骨细胞增殖的作用，可提高碱性磷酸酶活性并增加矿化结节形成的数量。结论 补肾中药血清具有刺激体外培养的成骨细胞增殖及分化成熟的功能。     

乌梢蛇蛋白对滑膜细胞增殖、凋亡及wt-p53／bcl-2mRNA表达的影响

目的研究乌梢蛇蛋白对体外培养的类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）生长的抑制情况,探讨乌梢蛇蛋白影响FLS凋亡的可能分子机制。方法常规方法提取乌梢蛇总蛋白,组织贴块法培养FLS;采用不同剂量（高、中、低剂量）乌梢蛇蛋白作用FLS后,应用MTT法检测乌梢蛇蛋白对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞的凋亡情况．RT—PCR方法检测细胞wt-p53／bcl-2 mRNA的变化。结果乌梢蛇蛋白中高剂量组FLS增殖率与空白对照组比较明显减少,细胞凋亡率明显增加．差异均有统计学意义（P〈0．01）;乌梢蛇蛋白中高剂量组FLS的wt-p53 mRNA表达量增加,Bcl-2mRNA表达量降低,与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论乌梢蛇蛋白可抑制FLS增殖和促进其凋亡。其作用机制可能是通过调节wt—p53／bcl-2基因表达来实现。     

水溶性乌梢蛇总蛋白的提取方法及细胞毒性检测*☆

背景：寻找分析乌梢蛇的具体活性成分,需对乌梢蛇总蛋白进行提取和分析,但目前有关乌梢蛇蛋白的提取方法甚少。目的：建立提取水溶性乌梢蛇总蛋白的方法,检验水溶性乌梢蛇总蛋白体外细胞毒性。方法：应用酶裂解与盐析相结合的方法提取乌梢蛇总蛋白,采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测盐析前后所得的蛋白浓度,使用SDS-PAGE分离蛋白,应用图像分析软件分析Quantity One 4.4 比较分析其区带差异。分别用盐析后所得的不同浓度的蛋白(0.5,5,50,150,450和900 mg/L)和蛋白提取液作用于成纤维样滑膜细胞,四甲基偶氮唑蓝法测定各组成纤维样滑膜细胞增殖率。结果与结论：水溶性总蛋白浓度与盐析总蛋白浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05);两种方法所提取的水溶性乌梢蛇总蛋白差异无显著性;提取液组和盐析后所得的蛋白质的150和450 mg/L组均可以抑制成纤维样滑膜细胞的增殖;而空白对照组和酶裂解与盐析后所得蛋白的0.5,5和50 mg/L对细胞的增殖作用无影响。提示酶裂解和盐析结合的方法可提取高质量低毒的水溶性乌梢蛇总蛋白,所提取蛋白包含了乌梢蛇的特征性蛋白,适合于体外细胞模型的研究。     

雌二醇与雷洛昔芬对体外培养成骨细胞生物学功能的影响及护骨素表达的调控

目的 比较雌二醇与雷洛昔芬对体外培养成骨细胞的生物学作用及对护骨素(OPG)表达的影响。方法 在新生SD大鼠头颅骨第二代成骨细胞培养液中加入不同浓度的雷洛昔芬,并设立雌二醇阳性对照及空白血清对照组;分别观察成骨细胞的增殖、分化和矿化功能;半定量RT-PCR测定成骨细胞中OPG基因的表达。结果 体外培养成骨细胞在加入不同剂量的雷洛昔芬后,细胞增殖率(A₅₇₀)、OPG蛋白表达与空白对照组相比均无明显差异(P>0.05);但碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节数明显升高,与空白对照组相比差异显著(P<0.05,P<0.01),且与雷洛昔芬浓度呈量效关系;雌二醇对成骨细胞的A₅₇₀值、ALP活性、矿化结节数量、OPG表达等的影响和对照组相比均有显著差异(P<0.01)。结论 雌二醇对体外成骨细胞生物学功能的影响非常显著,并可上调OPG蛋白表达及表达量;雷洛昔芬对体外成骨细胞分化矿化均有影响,但对增殖影响不显著;对OPG表达也无明显影响。此结果提示雷洛昔芬影响骨代谢可能不通过OPG代谢途径,它对体外成骨细胞的作用机制与雌二醇不完全相同。     

补肾中药对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:探讨补肾中药对破骨细胞(osteoclast,OC)骨吸收功能的影响。方法:取新生(出生24h内)SD乳鼠四肢骨髓分离培养OC,实验组加入不同(高、中、低)剂量的补肾中药血清,对照组采用无中药血清,采用酶动力学法测定培养上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)的活性;利用甲苯胺蓝对骨吸收陷窝染色并在图像分析仪下测定骨吸收陷窝的面积和数目。结果:补肾中药高、中剂量组均降低TRACP活性,减少骨片上骨吸收陷窝的面积及数目,与空白对照组比较差异有显著性意义(P<0.01),高、中剂量组间比较差异有显著性意义(P<0.05),以中剂量组作用为明显。结论:补肾中药可降低破骨细胞培养上清中的TR ACP活性,减少骨吸收陷窝面积及数目,达到抑制破骨细胞的骨吸收功能目的。