ABIN1对μ阿片受体活性的抑制作用

目的 A20结合的核因子抑制蛋白(ABIN1蛋白)是通过细菌双杂交技术筛选得到的与MOR羧基端(C-端)有相互作用的蛋白。本研究在确定ABIN1蛋白与μ阿片受体(MOR)相互作用的基础上,明确ABIN1对MOR受体激动活性及MOR激活后信号通路的影响。方法 (1)用GST-pull-down实验、免疫荧光细胞化学共定位及免疫共沉淀(Co-IP)实验验证ABIN1与MOR-C有无相互作用。(2)建立稳定转染ABIN1与MOR的CHO细胞株,用[3H]diprenorphine进行受体配体结合实验,观察ABIN1对MOR与配体结合力的影响。(3)用[35S]GTP-γS实验,观察ABIN1对MOR激动活性的影响。(4)通过SDS-PAGE电泳观察ABIN1对MOR激活后受体磷酸化及ERK/p-ERK水平的影响,通过cAMP含量测定确定ABIN1对DAMGO急性作用于MOR抑制cAMP作用的影响。结果 GST-pulldown实验在细胞外证明ABIN1与MOR-C有相互作用,免疫荧光细胞化学共定位实验表明ABIN1与MOR在胞膜存在共定位,Co-IP实验证明在细胞水平ABIN1与MOR有相互作用。[3H]diprenorphine受体配体结合实验表明ABIN1对MOR受体配体亲和力没有明显影响,[35S]GTP-γS实验证明ABIN1能够抑制激动剂对MOR的激动活性,EC50值显著增加(P<0.05)。量效曲线右移。ABIN1能够明显抑制DAMGO作用于MOR后对cAMP含量的降低作用(P<0.05),ABIN1明显抑制MOR的磷酸化(P<0.05),ABIN1对MOR激活后的p-ERK水平有明显的抑制作用(P<0.01),对ERK水平没有明显影响。结论 ABIN1与MOR相互作用后抑制MOR受体激动活性、MOR的磷酸化及受体后信号通路。     

小鼠源性ABIN1蛋白的抗体制备及功能验证

目的制备小鼠源性A20结合核因子κB活化抑制蛋白1（A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1,mABIN1）的多克隆抗体并进行功能验证,利用该抗血清对大鼠脑区ABIN1的分布进行验证。方法利用mABIN1片段与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）耦联得到的肽段为免疫原,免疫新西兰大耳白兔3次,共35 d,获得抗血清,分别用ELISA、蛋白免疫（Western）印迹和免疫组织荧光化学法对抗体的特异性进行验证;使用上述验证所得的特异性抗血清,通过Western印迹检测ABIN1在大鼠各脑区的分布;对所得到的特异性抗血清进行纯化。Western印迹证明,纯化后的抗体杂带较纯化前明显降低,但效价也有所下降。结果与结论成功制备了兔抗小鼠ABIN1抗血清并对抗血清进行纯化,经该抗血清首次验证ABIN1在大鼠嗅球、皮质、海马、纹状体、伏隔核、丘脑、下丘脑、小脑、脑干及脊髓等中枢神经系统不同部位均有广泛分布,为在动物体内进行ABIN1生物学功能研究提供了有利工具。     

压迫面积、时间和重量与大鼠挤压伤/挤压综合征的相关性研究

目的 研究压迫面积、压迫时间和压迫重量与局部损伤及全身病理生理反应的相关性,初步摸索可重复的挤压综合征大鼠模型. 方法 清洁级雄性SD大鼠72只,按随机数字表法分为18个小组(每组4只大鼠).将压迫面积(单、双侧后肢)、压迫重量(2,3,4 kg)和压迫时间(4,6,8 h)进行排列组合后形成18种压迫条件.所有大鼠在压迫开始前和解压后3 h测量受压后肢周径,同时取血检测K+、CK、Cr和BUN,并在实验过程中观察肌红蛋白尿的发生率;解压后24 h取其受压局部肌肉及肾脏进行病理切片检查. 结果 所有大鼠解压3 h后受压肢体均明显肿胀(P＜0.05).各组中K+、CK、Cr和BUN均随压迫面积、时间及重量的增加和延长而明显上升(P＜0.05).局部受压肌肉呈明显水肿和坏死表现;肾脏出现肾小球、肾小管充血,压迫重量≥3 kg、压迫时间≥6 h组可见肾小管坏死及管型. 结论压迫时间、重量及面积的增加和延长可增加挤压伤局部损伤和全身反应的严重程度.受压面积为双侧后肢、压迫重量≥3 kg、压迫时间≥6 h可较为稳定地造成大鼠典型的挤压综合征表现,可初步作为建立挤压综合征大鼠模型的实验条件.