酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胸水结核抗体的初步研究

本文以酶联单克隆抗人IgG为结合物,采用ELISA间接法检测了41例结核性胸膜炎、40例其它疾病患者胸水及血清中的抗PPD-IgG水平。结果显示结核病人抗体水平明显高于对照组(P<0.01)。本法检测胸水和血清抗体的灵敏度分别为85.4％和80.5％;特异度为92.5％和95.5％,提示此法可作为结核性胸膜炎的辅助诊断方法。     

酶联免疫吸附试验在结核性脑膜炎诊断中的初步应用

结核性脑膜炎的诊断目前主要依据临床表现、CSF的异常改变、OT试验及X线和细菌学检查。由于疾病早期临床表现和CSF改变往往不典型;OT试验阳性有助于诊断,阴性不能除外结脑;X线仅用于有无合并脑外结核的检查。尽管从CSF中查到结核酶即可确定诊断,但阳性率太低。国内报导涂片阳性约15～30％,培养约30～40     

结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的?     

结核分枝杆菌临床分离株药敏结果与耐药程度的关联分析

目的 探讨结核分枝杆菌临床分离株对12种抗结核药物的MIC值及其药敏检测结果 与耐药程度的关联规律,从而为临床制定治疗方案提供借鉴依据.方法 采用液体培养基联合MTT技术进行抗结核药物的MIC检测.对上海市肺科医院2009年1-6月间的163株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP、INH、SM、EMB、OFLX、LVFX、MOX、AMK、CPM、PTA、CLA和PAIN的MIC检测和Bactec MGIT快速培养仪药敏检测,并进行MIC与耐药程度的关联性分析.结果 67%(42/62)的SM耐药株MIC≥16 μg/ml,63%(51/81)的INH耐药株MIC≥8 μg/ml,77%(50/65)的RFP耐药株MIC≥8 μg/ml,20%(12/60)的EMB耐药株MIC≥4 μg/ml;43%(25/58)的OFLX耐药株MIC≥8 μg/ml;41%(15/37)的AMK耐药菌株MIC≥16 μg/ml,41%(12/29)的CPM耐药菌株MIC≥4 μg/ml.OFLX耐药株的3个氟喹诺酮类药物的MIC(OFLX、LVFX和MOX的MIC分别为2～128、1～32和0.0625～1 μg/ml)差异有统计学意义(F=16.874,P<0.01);SM、INH、RFP、EMB、OFLX、AMK和CPM在任6种及7种药物同时耐药株中的MIC值(分别为0.5～128、2～64、0.25～128、1～32、1～64、0.5～128和1～128μg/ml)明显高于任1种及2种药物耐药菌株的MIC值(MIC值分别为0.25～128、0.0625～64、0.25～32、0.25～2、0.125～2、0.5～4和1～4 μg/ml,F值分别为20.066、40.499、47.197、70.373、91.432、41.840和21.547,P均<0.05);SM、INH、RFP、EMB在4种药物同时耐药菌株中MIC值(分别为1～128、2～64、0.25～128和1～32μg/ml)显著高于任1种及2种药物耐药株(MIC值分别为0.25～128、0.0625～64、0.25～64和0.25～2 μg/ml,F值分别为26.242、23.563、31.541和64.469,P均<0.05);RFP在MDR酶株的MIC值(2～64 μg/ml)显著高于非MDR的耐药菌株的MIC值(0.25 μg/ml,F=5.613,P<0.05).结论 本研究揭示了常用的12种抗结核药物的耐药程度与常规药敏检测结果 之间的关联规律,为临床医生根据常规药敏结果 制定更加有效的抗结核治疗方案提供重要的借鉴.     

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原模拟表位的筛选研究

MTB分泌蛋白64(MPT64)是MTB重要的保护性抗原,也是结核病血清学诊断的理想抗原之一[1].然而目前报道MPT64抗原对血清标本的直接检出率较低[2].20世纪80年代兴起的噬菌体展示随机肽库(phage display peptide library)技术是一种快捷、高效分析蛋白分子间相互作用的工具[3],尤其适于筛选生物活性大分子的配体.     

显色法芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

 目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法。 方法 根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的分枝杆菌 16S rDNA 基因的保守区和突变区（第 129 ~ 267 位核苷酸的 A 突变区、第 430 ~ 500 位核苷酸的 B 突变区）分别设计引物和寡核苷酸探针，用地高辛标记引物并制备玻璃芯片。采用双重 PCR 技术分别对 16 种分枝杆菌标准株、5 种非分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株（非结核分枝杆菌 40 株、结核分枝杆菌复合群 80 株）进行扩增，扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测，尼龙膜显色，以显现蓝黑色斑点作为阳性信号，并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类。根据芯片杂交结果，选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行 DNA 测序。 结果 16 种分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株经 PCR 扩增均各产生 2 条 DNA 片段，其中 1 条长度为 272 ~ 280 bp，1 条长度为 183 ~ 192 bp。16 种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交，应用显色法芯片技术分析 16 种分枝杆菌标准株和 5 种非分枝杆菌标准株的特异性为 100%。120 株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针 a 杂交，其中 79 株确定为结核分枝杆菌复合群，38 株确定为非结核分枝杆菌（不产色分枝杆菌 17 株，胞内分枝杆菌 8 株，猿猴分支杆菌 6 株，瘰疬分枝杆菌 5 株，偶然分支杆菌 2 株），另 3 株只与分枝杆菌属探针 a 杂交，没有鉴定到种。选取的 26 株分枝杆菌临床分离株（结核分枝杆菌复合群 8 株，不产色分枝杆菌 5 株，胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各 3 株，瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各 2 株）DNA 测序显示，未鉴定到种的 3 株分枝杆菌中，1 株为结核分枝杆菌突变株，1 株为 Mycobacterium lentiflavum，1 株为 Mycobacterium arupense，芯片上无后 2 种菌株的特异性探针；其余 23 株菌株测序结果与芯片检测结果一致。 结论 显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，具有一定的临床推广应用价值。     

噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌阿米卡星耐药性方法的建立及应用评价

目的 建立结核分枝杆菌阿米卡星(Am)耐药性的噬菌体生物扩增法(PhaB)快速检测技术,并探讨其临床应用价值。 方法 通过不同菌量及药物浓度的筛选,建立PhaB测定结核分枝杆菌阿米卡星药敏检测方法;用该方法对108株结核分枝杆菌临床分离株进行了阿米卡星药敏检测,同步进行Bactec MGIT 960的Am药敏检测,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果不符合的菌株测定其Am的最低抑茵浓度(MIC)。 结果 以细菌接种量10^-3 mg／ml、药物浓度2 μg／ml、37℃作用48-h为药敏最佳检测条件,噬菌体检测108株结核分枝杆菌临床分离株阿米卡星敏感82株、耐药26株,Bactec MGIT 960检测敏感80株、耐药28株;2法测定均为敏感79株、均为耐药25株。以Bactec MGIT 960测定结果为判断标准,则PhaB的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值及符合率分别为89.3%、98.8%、96.2%、96.3%、96.3%。 结论 PhaB检测结核分枝杆菌的Am耐药性有较高的敏感性、特异性和准确性,整个检测只需3 d,且操作简单、不需特殊仪器设备,可作为 M .TB临床分离株Am药敏快速检测备选方法之一。     

结核分支杆菌耐药性快速测定方法及其评价

近年来 ,结核分支杆菌 (ＭＴＢ)耐药性问题日趋严重 ,已成为结核病控制的三大难题之一。由于传统的耐药性测定方法需时较长 ,远不能满足临床治疗的需要。因此 ,寻找快速、准确的耐药性测定方法已成为结核基础研究领域的一个重要课题 ,也是临床实践中亟待解决的问题[1,2 ] 。文中就耐药性快速测定的几种新方法研究进展综述如下。一、耐药性的表型检测方法1 快速培养仪检测系统 :该检测系统主要利用快速培养仪及Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ 7Ｈ9液体培养基来快速测定ＭＴＢ的耐药性。目前 ,所用的快速培养仪主要有ＢＡＣＴＥＣ ＴＢ 96 0、Ｂａｃ…     

结核病金标法免疫学诊断临床应用研究

本介绍的金标法结核抗体诊断药盒．应用特异性膜抗原，点样于硝酸纤维膜，运用间接法原理检测结核抗体，具有特异性强、敏感性高等特点，全程操作仅2分钟，是目前世界上结核病诊断最快捷的方法。     

耐多药结核分枝杆菌对利福布汀和利福平的交叉耐药性分析

目的 对耐多药MTB临床分离株进行利福布汀和利福平交叉耐药性研究分析,为利福布汀治疗耐多药MTB提供依据.方法 在96孔板上检测利福布汀和利福平对99株耐多药MTB菌株的90％最低抑菌浓度(MIC90),交叉耐药率数据分析采用x2检验,两组间MIC比较经对数转化后采用独立样本t检验.结果 利福布汀和利福平的交叉耐药率为85.9％(85/99).利福布汀的MIC90值为≤16 mg/L,中位数为2 mg/L;利福平的MIC9o值为≥2 mg/L,中位数＞32 mg/L,利福布汀MIC90值仅为利福平的1/8 ～ 1/32.利福布汀和利福平交叉耐药率随利福平的耐药程度加大而上升,低耐利福平组和中耐利福平组的交叉耐药例数分别为0/9和5/9,而高耐利福平组几乎全部交叉耐药(98.8％,80/81).结论 利福布汀对利福平耐药MTB菌株有一定的抗菌活性,可作为利福类药物耐药结核病的可选择药物.