C－myc反义寡聚脱氧核苷酸抑制人脑胶质瘤细胞系BT_（325）Myc蛋白合成和细胞增殖并诱导其分化的研究

目的：探讨在体外ｃ－ｍｙｃ反义核酸是否可通过阻断人脑胶质瘤细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达而抑制细胞增殖并诱导分化．方法：人工合成与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ起始码及其后四个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，用它处理培养的ＢＴ３２５细胞，观察它对细胞增殖的影响．同时用免疫细胞化学方法检测细胞中Ｍｙｃ蛋白的水平以及能反映胶质瘤细胞分化的Ｓ－１００和ＧＦＡＰ两种蛋白的水平，分析这些指标的变化．结果：发现４ｕｍｏｌ／Ｌ的ｃ－ｍｙｃ反义核酸明显抑制ＢＴ３２５细胞的增殖和Ｍｙｃ蛋白的合成，且后者发生在加入反义核酸后１ｈ，并持续２４ｈ以上，而细胞增殖受抑制要到第５日才明显．从第２日到第５日细胞中Ｓ－１００和ＧＦＡＰ染色明显加深，反映细胞有分化趋势．用同样长度的无关序列寡聚脱氧核苷酸作对照，则未见上述变化，表明ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用是序列特异性的．结论：ｃ－ｍｙｃ反义核酸可特异地抑制ＢＴ３２５细胞中Ｍｙｃ蛋白的合成和细胞增殖，并能诱导其分化．     

新的人抗HBsAg抗体Fab cDNA的克隆及序列分析

目的 从已构建的人抗－ＨＢsAg噬菌体抗体库中筛选出结合乙肝表面抗原（ＨＢsAg)的特异的人噬菌体抗体（Ｆab段）,并进行基础序列分析。方法 对噬菌体抗全库进行三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选,使特异性噬菌体抗体得到了富集,ＥＬＩＳＡ实验和ＥＬＩＳＡ竞争抑制实验鉴定出乙肝表面抗原的特异性抗体,同时对筛选出的克隆进行基因序列分析。结果 得到与乙肝表面抗原特异结合的抗体,并通过基因序列分析证明为抗乙肝ＨＢsAg的抗休天经地义人得到的抗惭肝ＨＢ－sAg的特异抗体为下一步表达纯化工作奠定了基础。     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

C—myc反义寡聚脱氧核苷酸抑制人脑胶质瘤细胞系BT325Myc蛋…

探讨在体外ｃ－ｍｙｃ反义核酸是否可通过阻断人脑胶质瘤细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达而抑制细胞增殖并诱导分化，方法：人工合成与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ起始码及其后四个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，用它处理培养的ＢＴ３２５细胞，观察它以细胞增殖的影响，同时用免疫细胞化学方法检测细胞中Ｍｙｃ蛋白的水平以及能反映胶质瘤细胞分化的Ｓ－１００和ＧＦＡＰ两种蛋白的水平，分析这些指标的变化，结果：发现４μ     

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱,用     

人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定

将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBs Fab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽的Linker使其连接成单链,克隆入中间载体,并进行核酸序列测定,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。     

重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究

目的　研究重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用 ,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性。方法　工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后 ,分步透析复性。复性后的HBscFv(0 .9g L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠 ,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度 ,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比 (结合率 ) ,同时以人血源HBsAbIgG(40U ml)和生理盐水作为对照。结果　两步纯化获得纯度达到 98%的重组HBscFv。HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为 (30 .4 7± 9.85 ) % ,与生理盐水组差异有显著性 (P <0 .0 0 1) ,与HBsAbIgG组差异无显著性(P >0 .0 5 ) ;对照品HBsAbIgG的结合率为 (39.0 0± 7.4 3) % ,与生理盐水组差异也有显著性 (P <0 .0 0 1)。比较HBscFv和HBsAbIgG的结合率及其浓度 ,求得HBscFv的结合效价为 31.5 8U mg。结论　HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性 ,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型。     

构建分泌型HBsAg单链抗体在毕赤酵母菌中的表达研究

为了从巴氏毕赤酵母中获得分泌表达的非融合人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv ) ,设计引物从pGEM HBscFv上扩增HBscFv,亚克隆至P pastoris表达载体pPICZαA中 ,然后转化P pastorisGS115、KM71,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,甲醇诱导目的蛋白表达并对其性质进行鉴定。结果发现 ,3%～ 5 %的转化子具有 2 0 0 0mg/LZeocin抗性 ;转化子诱导后 ,可以合成并分泌相对分子质量为 32 0 0 0的HBscFv ,表达量占酵母培养上清中总蛋白的 2 2 % ;酵母表达产物可被针对大肠杆菌来源HBscFv的单克隆抗体特异性识别 ,并具有结合HBsAg活性。     

人源性抗HBsAg单链Fab基因在Pichia pastoris中的表达

目的：研究重组Fab的结构与亲和活性的关系：方法：通过重叠PCR，将人源性抗HBsAg Fab的H和L链基因融合构建单链Fab基因，并将其转入毕赤酵母表达载体pPICZαA中。以单链Fab基因表达载体通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115。将获得的重组酵母在摇瓶中培养进行重组单链Fab的可溶性表达。表达上清经硫酸铵沉淀及亲和层析纯化后，用直接ELISA检测表达产物和纯化Fab的活性：结果：SDS—PAGE和Western blot分析显示，单链Fab在毕赤酵母中获得分泌型表达。薄层扫描显示，在摇瓶中培养毕赤酵母表达的单链Fab约为5～10mg／L。经亲和层析纯化获得纯度达97．8％的重组单链Fab。经直接ELISA测定的结果显示，重组单链Fab具有较好的结合HBsAg的活性。结论：通过重叠PCR构建的融合单链Fab基因，可成功地在毕赤酵母中获得分泌型表达，表达产物具有较好的结合HBsAg的活性。