海洋青铜小单孢菌FIM 02-523全基因组测序及分析

青铜小单孢菌(Micromonospora chalcea, M. chalcea)FIM 02-523能够合成对乏氧肿瘤细胞、艰难梭菌等具有活性的环脂肽类化合物rakicidins。利用Illumina HiSeq高通量测序平台,本研究首次对M. chalcea FIM 02-523进行全基因组测序,得到总长约6.74Mb的序列信息。分析表明基因组GC含量为72.89%,包含了6167个蛋白编码序列。利用AntiSMASH预测基因组中存在19个生物合成基因簇。结合PKS/NRPS生物合成特征和rakicidins化学结构特点,定位到了rakicidins的生物合成基因簇,并初步推测其生物合成途径。研究为M. chalcea FIM 02-523的功能基因组学研究和代谢调控提供了理论基础。     

芳香聚酮类化合物产生菌的分子筛选及其代谢产物的研究

目的 建立一种芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法并获得相应结构类型的化合物.方法 依据芳香聚酮类化合物生物合成途径所用的Ⅱ型酮基合酶的同源性设计简并引物,通过PCR方法扩增出约0.6kb目的基因片段,同时通过同源进化和抗菌活性分析对海洋放线菌是否产生芳香聚酮类化合物进行早期评估,并最终从阳性菌中分离得到相应结构类型的化合物.结果 利用建立的芳香聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对100株海洋放线菌进行筛选,获得了18株携带Ⅱ型酮基合酶基因的阳性菌株,通过同源进化和抗菌活性分析后从中筛选到1株与多环氧杂蒽酮类化合物lysolipin和xantholipin的酮基合酶基因同源的野野村菌(Nonomuraea sp.)FIM02-765,并最终从该菌中分离得到多环氧杂葸酮类化合物simaomicin α.结论 本研究通过聚酮合酶编码基因的同源进化分析以及建立起来的Ⅱ型酮基合酶基因与化合物之间的联系,验证了芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法的可行性,同时本文还首次从野野村菌(Nonomuraea sp.)中分离得到多环氧杂葸酮类化合物simaomicin α,这些都为高效利用海洋放线菌资源和基因资源奠定了一定的基础.     

一种多拷贝串联基因的链霉菌表达载体的构建方法

目的：建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体 pSET152为基础,构建表达载体pFIM001。该质粒携带链霉菌强启动子PermE*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体pFIM001插入了 tcsD 基因构建质粒 pFIM101,并且引入了XbaⅠ及SpeⅠ等位点;通过表达盒串联定向克隆法完成多拷贝tcsD的插入。结果成功构建外源多拷贝基因表达载体 pFIM001,建立了表达盒串联定向克隆法,获得含不同拷贝tcsD基因的质粒。结论可以用这个方法构建多拷贝基因质粒。     

绛红色小单孢菌G1008接合转移体系的构建

目的 构建绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)的接合转移体系,并对该体系进行优化.方法 以绛红色小单孢菌G1008染色体DNA为模板,经PCR扩增甲基化酶基因gntK的上下游序列各2000bp左右作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间.以温敏型质粒pKC 1139作为基本载体,构建重组质粒pFD306.借助接合转移技术,将该质粒导入绛红色小单孢菌G1008.结果 经抗性筛选,得到一株阳性菌株,命名为GK1008,经PCR鉴定和测序,验证了重组质粒已整合到染色体上.GK1008菌株对红霉素和安普霉素的抗性均超过500μg/mL.结论 绛红色小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的,并实现了对该体系的优化,这为其它小单孢菌的分子遗传学操作提供了借鉴.     

支链氨基酸代谢在糖肽类和环脂肽类抗生素产量提高与组分优化中的应用

摘要：糖肽类和环脂肽类抗生素具有很好的抗菌活性,临床上广泛用于治疗多重耐药菌导致的严重感染。大部分糖肽类和 环脂肽类抗生素均含有带支链结构的脂肪酸侧链,侧链结构差异是导致这两类抗生素发酵组分多样性的主要原因。支链脂肪酸 侧链的合成起始于支链氨基酸分解代谢,调控支链氨基酸代谢对于定向合成含有特定脂肪酸侧链的糖肽类和环脂肽类抗生素具 有重要作用。本文从糖肽类和环脂肽类抗生素中脂肪酸侧链的生源途径、外源添加支链氨基酸对糖肽类和环脂肽类抗生素产量 和组分的影响,内部改造支链氨基酸代谢途径对糖肽类和环脂肪肽类抗生素产量和组分的影响3方面进行了综述。     

海洋微生物来源的肿瘤细胞抑制剂rakicidin B在乏氧条件下的作用机制初探

探索海洋微生物来源的rakicidin B在乏氧条件下对人结肠癌细胞系HCT-8细胞的作用机制。本研究采用克隆形成实验、划痕法和Transwell法测定rakicidin B对乏氧条件下HCT-8细胞克隆形成能力、细胞迁移与侵袭的影响;以实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测HCT-8细胞株内HIFs关键基因(HIF1α、HIF2α)以及下游调控因子(VEGF、GLUT1、ABCG2、OCT4)转录水平及蛋白表达情况。实验结果表明：在乏氧条件下,rakicidin B可以抑制HCT-8细胞的克隆形成以及迁移与侵袭;同时,rakicidin B可以显著下调缺氧诱导因子以及相关蛋白的转录与表达水平。初步揭示rakicidn B在乏氧条件下抑制肿瘤细胞HCT-8增殖的分子机制是通过HIF1α和HIF2α信号通路调节下游相关基因转录与表达的结果。     

利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA的全基因组测序与分析

摘要：目的 解析利普斯他汀(lipstatin)高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA (S. toxytricini AP617-N12CA)的基因组序列信息,为深入研究该菌株高产lipstatin的分子机理与调控机制奠定基础。方法 联合应用三代单分子测序技术和二代高通量测序技术对AP617-N12CA菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行进基因组组装、基因预测和功能注释,并对lipstatin及其他次级代谢产物生物合成基因簇进行分析预测。结果 AP617-N12CA菌株整个基因组大约6.99Mb,GC含量73.76%,含有6134个编码序列;基因组由一条长约6.38Mb的线型染色体和一个长约0.61Mb的线型质粒组成;同时预测得到22个次级代谢产物合成基因簇,其中lipstatin基因簇定位在线型质粒右臂区域而非在染色体上。结论 首次完成了AP617-N12CA菌株全基因组完成图绘制,在S. toxytricini菌中首次发现和描述了线型质粒,在线型质粒上定位并鉴定分析了lipstatin基因簇。为S. toxytricini的功能基因组学研究和lipstatin高产机理解析提供了基础数据,对后续相关研究具有重要意义。