在线固相萃取-高效液相色谱法测定血清中的茶碱

目的:建立一个准确、简单、快速的分析人血清中茶碱含量的方法,并应用于临床治疗药物监测。方法:利用双三元液相色谱系统(Ulimate3000系列),经C₁₈MG S-3(20 mm×4.0mm,A3JW)固相萃取柱进行在线固相萃取,使用Acclaim C₁₈(150 mm×4.6 mm,5μm)进行分离,梯度洗脱,检测波长273 nm,柱温30℃。结果:利用在线固相萃取液相色谱法测定血清中茶碱的方法检出限为0.10 mg·L^-1,定量限为0.35 mg·L^-1;线性范围为0.35~20 mg·L^-1,R^2=0.999 8;当加标浓度范围为0.35~10 mg·L^-1时,回收率范围为97.28%~103.1%,RSD为0.52%~1.72%。结论:本方法简便、快速,可用于血清中茶碱的临床血药浓度监测及药动学研究。     

膜层析杂交方法的建立

[目的]建立一种快速、简便的核酸杂交检测模式。[方法]合成寡核苷酸探针固定于高流速硝酸纤维素层析膜的反应区(reaction zone，RZ)，溶于杂交液中的待杂交的DNA分子上样于层析膜的一端，在毛细管力的作用下，DNA在膜上移动并在RZ与固定探针杂交结合，同理，以标记有生物素的显示探针与靶核酸层析杂交，最后通过与链亲合素-碱性磷酸酶(SA-AP)接头结合，由AP的底物NBT／BCIP显色系统判断结果。[结果]生物素标记探针直接固定，进行显色反应后显色灵敏度为10fmol；膜层析杂交后的显色度没有降低；与斑点杂交方法比较，在灵敏度未降低的情况下，膜层析杂交可在2h内迅速完成。[结论]该方法简便、快速，适合较多探针的杂交，结果容易判断，不需要特殊仪器设备，对于病原体的快速、灵敏检测有着广泛的应用前景。     

基因重组人血红蛋白的纯化

目的 :探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法 :将α、β珠蛋白串联基因克隆进 pBV2 2 0表达载体 ,获得了高效表达 ,表达产物达细菌总蛋白的 2 0 %左右。该表达产物以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤后 ,用 8mol/L尿素溶解 ,先用Q SepharoseFastFlow阴离子交换纯化后 ,又经Sephacryl 10 0凝胶过滤纯化。 结果 :经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达 90 %左右。纯化产物经复性 ,具有与氧结合的能力。结论 :成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法     

HLA—DR分子的分离纯化

目的：纯化HLA－DR。方法：纯化抗HLA－DR单克隆抗体1243并与CNBr活化的Sepharose4B偶联亲和柱,应用免疫亲和层析方法纯化HLA－DR分子。结果;从5g HLA-DR阳性的人B淋巴瘤细胞系RAJI裂解液中得到20μHLA-DR分子。它们以二聚体形式存在,能与构象依赖型单抗L243进行结合,煮沸变性后分开为α和β两条单链。这为MHCⅡ类分子抗原表位研究奠定了基础。     

枝状DNA信号放大与纸层析杂交检测方法的建立

血清中病原体的核酸 (ＤＮＡ或ＲＮＡ)水平可确切地反映病原体的复制能力。现有诊断方法中多以各种模式的聚合酶链式反应 (ＰＣＲ)为主 ,该方法灵敏度较高 ,但需要依赖一些设备 ,且易出现假阳性。测定分子水平的技术多因要求高 ,一般临床较少开展。近年发展了极为敏感的枝状ＤＮＡ (ｂｒａｎｃｈｅｄＤＮＡ ,ｂＤＮＡ)分析技术 ,通过一系列的杂交反应后 ,由显示探针上的酶催化发光底物发光 ,由光电比色计可定量记录信号 ,从而达到对病原体核酸的定量分析目的。纸层析杂交试验利用了毛细作用力使ＤＮＡ分子在膜上移动 ,通过杂交作用被固定在…     

突变型血红蛋白基因(α_(99),β_(82)Lys→Cys)的克隆和筛选

目的 :将编码血红蛋白α99,β82 位Lys的密码子突变为编码Cys的密码子。方法 :将待突变的目的基因克隆到 pALTER Ex2载体上 ,采用寡核苷酸介导的定点突变进行突变。 结果 :初步筛选得到的克隆经序列测定表明 ,达到预期设计的目的 ,未发生意外突变。结论 :该结果为进一步开展突变型重组血红蛋白表达和纯化的研究奠定了基础     

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳三种银染方法比较

目的　探讨DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)三种银染方法的特点及其适用性。方法　采用非变性PAGE垂直板对不同稀释度的 pBR 32 2MspⅠ分子量标准进行电泳分离 ,利用二种硝酸银染色法和一种银氨染色法染色 ,分析其灵敏度和噪声。结果　分子量Marker的所有条带都能染出灵敏度均为 2 5ng。在至少一个条带能染出的灵敏度方面 ,银氨染色法 ( 6 .2 5ng)低于其他两种方法。结论　时间方面Carlos等所建立的银染方法最快 ,仅需 2 0min。银氨法的噪声最低 ,结果易于保存。Brant等所建立的银染方法在实际应用中不占优势     

丙型肝炎病毒优势表位嵌合抗原在大肠杆菌中的表达及其在血清学检测中的应用

目的 获得具有多表位的丙型肝炎病毒（HCV）嵌合抗原，以提高HCV酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断试剂的质量。方法 采用分子克隆将己获得的HCV各区段优势抗原表位基因，拼接为HCV嵌合抗原基因。将该基因克隆到pQE-30载体表达。表达抗原经纯化后，包被酶联板，对16份HCV阴性和16份阳性血清标本进行了检测。结果 pQE-HCV在大肠杆菌中有效表达了相对分子质量对53000的HCV嵌合抗原。经Ni-NTA金属螯合层析纯化后，获得了高纯度的目的蛋白。ELISA结果显示，HCV嵌合抗原能特异地与HCV感染血清反应，具有良好的抗原活性。结论 HCV多表位嵌合抗原包含了HCV具有代表性的主要表位，是HCV免疫学检测的良好试剂。     

突变型(α99,β82位Lys-Cys)人重组血红蛋白的纯化

将基因突变型（α９９,β８２位Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）血红蛋白在ｐＢＶ２２０载体中诱导表达,表达产物达细菌总蛋白的２０％左右。该表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,先用Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换纯化,再经Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ－１００凝胶过滤纯化。纯化产物经复性,具有与氧结合的能力。