建立只标记加成碱基的^32P后标记法以用于检测致癌物—DNA加成物

本文报道建立~(32)P后标记方法(~(32)P-Postlabeling Method)以用于检测致癌物-DNA加成物。其基本原理:用核酸酶P1(Nu.P1)完全消化DNA,释出5′单磷酸脱氧核苷(pN),而加成的碱基(Xi),则释出5′磷酸二脱氧核苷(pXipN);经前列腺酸性磷酸酶(PAP)作用后,分别生成N和XipN,然后经T_4多聚核苷酸激酶(PNK)作用,将[γ-~(32)P]ATP的~(32)P转移XipN的5′末端上,生成标记*pXipN而N不被标记。经聚乙烯亚胺(PEI)纤维素薄层纯化、分离和放射自显影,则可确定已加成的碱基,若DNA量已知,则可进行定量分析。在人羊膜上皮细胞FL中,适量苯并(a)芘[B(a)P]处理24b后,可分离到4个加成物斑块,其总相对标记量(Relative Adduct Labeling,RAL)有剂量依赖性关系。     

细胞色素P450调节剂对DNA加合物形成的影响

人羊膜上皮细胞ＦＬ系分别接触ａ－萘黄酮（０．６ｍｍｏｌ·Ｌ￣（－１））β－萘黄酮（２０ｐｍｏｌ·Ｌ￣（－１））２４ｈ后，再用苯并（ａ）芘［Ｂ（ａ）Ｐ，１０ｕｍｏｌ·Ｌ￣（－１）］处理２４ｈ，用３２Ｐ后标记技术测定以Ｂ（ａ）－ＤＮＡ加合物。结果发现，阳性对照组，ａ－萘黄酮预处理组及β－萘黄酮预处理组加合物的量分别为（加合物个数／１０’个核苷酸）：４．７±０．２（１００％），１．８±０．９（３８．３％），１６．０±２．２（３４０．１％）．该实验结果直接显示了纳胞色素Ｐ４５０调节剂对肿瘤发生影响的作用水平。亦为药物对致癌物代谢影响的研究提供了一种方法．     

细胞色素P450 1A1cDNA表达质粒的构建及转基因细胞系的建立

将ＣｙｔＰ４５０１Ａ１ｃＤＮＡ片段亚克隆至哺乳动物细胞高表达型穿梭载体中，酶切图谱显示片段被正向克隆于多克隆位点中。运用电穿孔法将重组质粒转入人羊膜ＦＬ细胞中国仓鼠ＣＨＬ及Ｖ７９细胞中，经Ｇ４１８筛选３周后获得抗性细胞克隆，并扩大成系。     

THE EFFECTS OF TRANSCRIPTION AND TRANSLATION INHIBITION ON NONTARGETED MUTAGENESIS IN MAMMALIAN CELLS

在研究ＭＮＮＧ所致哺乳类细胞非定标性突变时相变化的基础上，以ＲＮＡ合成抑制剂放线菌素Ｄ（ＡＭＤ）和蛋白质合成抑制剂放线菌素酮（ＣＨＭ）在ＭＮＮＧ处理后非定标性突变频率最高的６ｈ点分别阻断ＤＮＡ转录和翻译，发现ＡＭＤ能使ＭＮＮＧ诱导的ｖｅｒｏ细胞非定标性突变率下降至对照水平，而ＣＨＭ则使其明显上升。提示ＭＮＮＧ引起的ＤＮＡ损伤能够通过诱导某些基因的表达或干扰某些蛋白质的功能而导致基因组遗传不稳定。     

一个参与N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱发的遗传不稳定的cDNA片段的分离筛选

为研究甲基硝基亚硝基胍 ( MNNG)诱发猴肾vero细胞遗传不稳定的机理 ,采用 m RNA差异显示分离到的 MNNG处理后表达发生改变的表达序列标识 ( EST)相关基因进行功能筛选 .利用反义核酸阻断技术阻断其相应基因的表达 ,以筛选分离参与非定标性突变形成的 c DNA片段 .现筛选到 1 0号片段 ,其相关基因的表达被阻断后 ,MNNG诱发的 vero细胞非定标突变率下降至自发突变水平 ,提示 1 0号片段相关的基因是非定标突变发生的正相关基因 .     

本室克隆的人细胞色素P450 1A1 cDNA序列特点

本实验室于 1994年用人羊膜ＦＬ细胞株 ,经逆转录 ＰＣＲ克隆了人细胞色素Ｐ4 5 0 1Ａ1ｃＤＮＡ ,经部分ＤＮＡ序列测定〔董海涛等 ,中国病理生理杂志 1995 ,11(4) :4 17- 4 2 1〕 .并建立了稳定表达ＣＰＹ1Ａ1的转基因细胞 ,其表达产物具有乙氧基异吩 口恶唑 Ｏ 去乙基酶活性 ,建立的转基因细胞有代谢活化苯并 [α]芘等多环芳烃的能力〔董海涛等 ,中国病理生理杂志 1996 ,12 (3) :2 2 5 - 2 2 9〕 .现用Ｔ7,ＳＰ6引物和重新设计的中间引物 ,根据Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ操作说明书 ,用ＢｉｇＤｙｅ标记的双脱氧链终止法反应 ,再在本实验…     

化学诱变剂诱发基因突变分子机理研究

应用一将突变靶基因与哺乳细胞组ＤＮＡ相分离的实验体系,证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中,并有突变谱特征和突变好发的序列特异性。它的发生依存于化学 变剂诱发的基因表达改变,应用ｍＲＮＡ差异显示和反义技术分到两个基因表达序列标识,其相关基因表达被阻断后可分别促进和抑制化学诱变剂诱发的非定标性突变。     

(ADPR)_n与真核细胞的DNA修复

多聚ADP-核糖[(ADPR)_n]是六十年代新发现的普遍存在于真核细胞核内的一类核酸大分子。它由一种特异的核内酶——多聚ADP-核糖聚合酶或称ADP-核糖基转移酶(AD PRT)以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为底物催化生成。近二十年来,各国学者对(ADPR)_n的结构,功能进行了广     

鞘脂类研究进展

鞘脂类一直被认为仅是细胞结构的组成部分,随着研究的深入,人们发现它是重要的信号分子,与细胞的生长、老化、减数分裂、成熟和死亡都紧密相关,还参与肿瘤侵袭、热休克反应和遗传毒性应激反应等.因此,对鞘脂类代谢进行干预是一种潜在的治疗肿瘤的手段.