转化生长因子-β（TGF-β）空间动态分布的角膜基质创伤修复体外三维培养体系的构建

目的　研究构建模拟角膜基质创伤修复过程中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）空间动态分布的体外三维培养系统。方法　从新鲜牛眼中分离角膜基质细胞，用含体积分数10％胎牛血清（fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培养基进行培养，而后构建Pellet体外三维培养模型进行培养。将Pellet分为有透析袋组和无透析袋组，置入Transwell小室系统上下室中培养48 h后换液，上室为0.50 μg·L^-1TGF-β1+0.25 μg·L^-1TGF-β2+体积分数10％FBS，下室为体积分数10％FBS，分别于培养后72 h观察Pellet培养模型的形态变化并采用Real-time PCR法分别检测2组上下室Pellet中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）和Col Ⅲ mRNA相对表达量。结果　培养后72 h Pellet均呈团状生长。有透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为1.595±0.025、1.148±0.009，FN mRNA表达量分别为1.090±0.011、0.844±0.015，Col Ⅰ mRNA表达量分别为1.445±0.035、1.165±0.008，Col Ⅲ mRNA表达量分别为1.726±0.031、1.314±0.020，Col Ⅲ/Col Ⅰ比值分别为1.126±0.019、0.957±0.013，上下室各项指标比较差异均有统计学意义（均为P=0.000）。无透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为1.363±0.018、1.360±0.002，FN mRNA表达量分别为0.946±0.017、0.952±0.012，Col Ⅰ mRNA表达量分别为1.261±0.011、1.258±0.029，Col Ⅲ mRNA表达量分别为1.459±0.027、1.462±0.033，Col Ⅲ/Col Ⅰ比值分别为1.157±0.029、1.163±0.090，上下室各项指标比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。无透析袋组上室细胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。无透析袋组下室细胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　Transwell小室系统与透析袋相结合可构建模拟TGF-β空间动态分布的体外三维培养系统。     

低剂量TGF-β1维持三维培养模型中牛角膜基质细胞生长和缓解细胞外基质纤维化的作用

背景 转化生长因子(TGF)-β1在角膜损伤修复过程中发挥重要作用,不同剂量的TGF-β1对角膜细胞外基质(ECM)的合成具有不同影响,从而影响瘢痕形成的程度.既往研究多集中于高质量浓度TGF-β1对二维培养的角膜基质细胞的影响,而低质量浓度TGF-β1对角膜基质细胞ECM合成的影响鲜见研究.目的研究低质量浓度TGF-β1对体外三维培养的角膜基质细胞生长状况及ECM合成的影响. 方法 采用两步胶原酶消化法从新鲜牛眼中分离牛角膜基质细胞并置于含体积分数10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基,利用Pellet体外三维培养模型对牛角膜基质细胞进行培养.将细胞分为0.25 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组,分别于培养后48 h、1周、2周、3周观察Pellet培养模型的形态变化.于培养后3周采用苏木精-伊红染色法对Pellet培养模型进行常规组织形态学检查,采用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法(Calcein-AM/PI法)于激光扫描共焦显微镜下检查角膜基质细胞的死亡率;采用实时荧光定量PCR及免疫荧光细胞化学法分别检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和ColⅢmRNA及其蛋白的相对表达量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中角膜蛋白(KERA)mRNA和基膜聚糖(LUM)mRNA的表达.结果 培养后48 h、1周、2周和3周Pellet细胞均成团生长.苏木精-伊红染色可见,Pellet球内均有大量红色淡染的胶原纤维以及大部分正常的成纤维细胞和少量坏死的成纤维细胞,坏死细胞可见细胞形态破坏,呈均质红染,且0.25 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组培养细胞形态无明显差别.0.25 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组和0.50 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组细胞死亡率分别为(33.60±1.65)％和(30.90±0.78)％,差异无统计学意义(t=0.144,P=0.887).0.25 ng/ml TGF-β1+5％FBS组Pellet培养模型中α-SMA、FN、ColⅢ蛋白表达量均低于0.50 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组,差异均有统计学意义(tα-SMA=4.622,P=0.010;tFN=2.973,P=0.040;tCol Ⅲ=7.845,P＜0.001),0.25 ng/ml TGF-β1 +5％ FBS组Col Ⅰ的表达量明显高于0.50 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组,差异有统计学意义(tColⅠ=4.022,P=O.016).在转录水平和蛋白表达水平,0.25 ng/ml TGF-β1 +5％ FBS组ColⅢ/Col Ⅰ比值均低于0.50 ng/ml TGF-β1+5％FBS组,差异均有统计学意义(tmRNA=-3.039,P=0.038;t蛋白=3.215,P=0.032).培养后48 h、1周、2周Pellet培养模型中KERA mRNA和LUM mRNA均呈阳性表达,0.25 ng/ml TGF-β1+5％ FBS组LUM mRNA相对表达量随培养时间延长而逐渐增加;0.50 ng/ml TGF-β1 +5％ FBS组LUM mRNA相对表达量于培养后1周时达峰值.2个组Pellet培养模型中KERA mRNA相对表达量均在培养后1周达峰值. 结论 低剂量的TGF-β1既能够维持Pellet体外三维培养模型中角膜基质细胞的生长并合成ECM,也使ECM组成成分的合成倾向于正常状态,以减少瘢痕化修复的趋势.