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hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。 相似文献
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目的:分析甲醛染毒对体外培养的人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)内8-羟基鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxo-dG)水平、DNA5-甲基胞嘧啶(5-mC)含量的影响及其时间-效应和剂量-效应关系,探讨甲醛所致的细胞DNA氧化与DNA甲基化的关联性。方法:用5~20μmol/L甲醛作用于A549细胞,用高压液相色谱串联电化学检测技术分析细胞DNA8-oxo-dG水平,用免疫荧光和高效毛细管电泳法检测细胞全基因组DNA5-mC含量改变。 结果:甲醛染毒提高了细胞8-oxo-dG水平,但是降低了细胞的DNA5-mC含量。甲醛致细胞DNA氧化与DNA甲基化呈现不同特点,A549细胞暴露于20 μmol/L 甲醛后,DNA氧化水平在1周甚至更早时间就已显著增高,而相同条件下DNA 甲基化水平的改变需要6周以上的时间,DNA 甲基化的改变滞后于DNA氧化。 A549细胞经5~20μmol/L甲醛染毒8周后,DNA氧化水平与甲醛剂量呈正相关关系,而同样条件下DNA甲基化水平与甲醛剂量呈负相关关系。 结论:甲醛染毒可提高DNA氧化水平,降低细胞DNA甲基化水平。在甲醛的毒作用效应中,细胞DNA氧化损伤可能是早于其DNA甲基化的一个重要分子事件。 相似文献
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建立牛角膜混浊和渗透性(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)试验,并探讨其用于化妆品眼刺激性评价的预测能力。
选取10种参考化学品进行BCOP试验,并对本实验室日常受理的16件化妆品进行眼刺激性预测。检测受试物暴露后角膜混浊度和荧光素钠渗透性2项参数的变化,计算体外评分值,并与传统动物实验历史数据进行比对分析。
10种已知刺激性分类的参考化学品经BCOP试验测试评价后均被正确分类,得到的分类结果与全球化学品统一分类和标签制度分类结果一致。化妆品的BCOP测试结果显示,BCOP试验对无刺激性样品检测的特异度为80.0%(8/10),对弱到中刺激的预测灵敏度为83.3%(5/6),与体内试验比对,总体分类一致性达81.3%(13/16)。
BCOP试验可单独用于识别无危险性分类和具有严重眼损伤或眼刺激性的化学品,在化妆品眼刺激性体外整合测试策略中具有重要的应用价值。
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目的探讨三聚氰胺染毒对大鼠肾组织c-myc,c-fos和N-ras基因mRNA表达水平的影响。方法用三聚氰胺对SD大鼠进行亚急性经口染毒,设1个对照组和3个实验组,每天对动物采用经口灌胃染毒1次,染毒时间28d,试验结束时取大鼠肾组织进行荧光定量PCR检测c-myc,c-fos和N-ras基因mRNA表达水平。结果雄性大鼠三聚氰胺染毒后c-myc、c-fos、N-ras mRNA表达水平分别为1.72~3.39,2.34~4.03,2.92~12.08,与对照组比较明显增强(P<0.05,或P<0.01);雌性大鼠三聚氰胺染毒后c-myc、c-fos、N-ras mRNA表达水平分别为1.56~2.93,2.03~3.52,2.65~10.87,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05,或P<0.01)。结论三聚氰胺亚急性染毒引起大鼠肾组织部分癌基因表达水平升高。 相似文献
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结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化的改变 总被引:1,自引:0,他引:1
Objective To observe the effect of crystalline NiS on genome DNA methylation profile in in vitro cultured cells.Methods 16HBE Cells were treated with crystalline NiS at 0.25,0.50,1.00 and 2.00 μg/cm2 for 24 h and three times at total.DAC treatment was given at 3 μmol/L for 72 h.5-mC immunofluorescence and SssI emthyltrasferase assay methods were applied to investigate if the hypomethylation of genome DNA involved.Results The results of 5-mC immunofluorescence showed that the fluorescence intensity of NiS-treated cells were decreased in some degree, and transformed cells were decreased dramatically.By the SssI methylase assay, an average of (81.9 ± 7.3 )% methylated CpG were found in negative control cells.By contrast, ( 77.9 ± 6.2) %, ( 75.3 ± 6.8 ) %, ( 59.5 ± 4.9 ) %, ( 67.4 ±5.1 ) % methylated CpG were observed in cells treated with NiS for three times at dosage of 0.25,0.50,1.00and 2.00 μg/cm2 which were abbreviated as NiS0.25, NiS0.50, NiS1.00, NiS2.00 respectively.The ANOVA analysis results showed that there was a significant difference in the 5 groups above ( F = 124.95,P <0.01 ).The results of Dunnett-t test showed that the methylated CpG of both group NiS1.00 and NiS2.00were significantly decreased compared with the negative control group(t values were 7.64,4.89 respectively,P <0.01 ).For methylated CpG, (46.2 ±4.1 ) % and (43.6% ±4.3)% were observed in NiS-transformed cells (NSTC1 and NSTC2) which were dramatically decreased compared with the negative control group(t values were 12.79,13.56 respectively, P < 0.01 ).Conclusion Genomic DNA methylation levels were decreased during NiS induced malignant transformation. 相似文献
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【目的】探讨高糖暴露对脑微血管内皮细胞通透性的影响。【方法】选取小鼠脑微血管内皮细胞系(bEnd.3)作为研究模型,检测跨内皮细胞电阻值(TEER)、碱性磷酸酶(ALP)及γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的活性,对细胞模型的血脑屏障特征进行鉴定;再通过细胞形态学、细胞活力、细胞内乳酸脱氢酶活性及ZO-1、Occludin基因相对表达量的变化评价高糖暴露对脑微血管内皮细胞通透性的影响。【结果】细胞的TEER值、ALP及γ-GT的活性随细胞培养时间的增加而逐渐升高;细胞形态学结果显示,高糖作用下细胞数目明显减少,贴壁不稳;细胞活力实验显示,经葡萄糖暴露处理后,受试细胞活力呈剂量和时间依赖性降低;随着葡萄糖暴露浓度的增高,细胞内乳酸脱氢酶活性逐渐增高,各剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,对紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的mRNA表达水平进行检测发现,高糖暴露可抑制ZO-1、Occludin基因的表达,且表达水平呈剂量依赖性降低。【结论】体外培养的bEnd.3细胞模型具有血脑屏障的特征,高糖暴露能够抑制紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达,该结果可能与脑微血管内皮细胞通透性的改变有关。 相似文献
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目的 建立重组人角膜模型SkinEthicTM体外替代方法并探讨其用于化学品眼刺激性评价的预测能力。方法 选取11种已知刺激性分类的标准化学品(包括5种固体化学品和6种液体化学品;涵盖不同溶解度、含自身颜色反应以及与MTT发生直接还原反应的化学品),采用重组人角膜模型SkinEthicTM评估其作为体外眼刺激性替代方法的可行性。以MTT法测定细胞活性作为检测终点,设置相对细胞存活率50%(固体)或60%(液体)为判定依据来预测刺激性和非刺激性。结果 11种已知刺激性分类的化学品经重组人角膜模型测试,其中7种被正确评价为刺激性物质(3种固体和4种液体),4种被评价为非刺激性物质(2种固体和2种液体)。评价方法在灵敏度与特异性方面均表现良好,可区分无危险性分类和具有潜在风险性(严重眼损伤/眼刺激性)的化学品,得到的分类结果和UN GHS分类结果一致。结论 基于重组人角膜模型SkinEthicTM的眼刺激性体外替代方法可用于快速预测和评价无危险性分类和严重眼损伤/眼刺激性化学物质。 相似文献
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