北京市儿童肠道感染相关腺病毒的病原学研究

目的:了解北京市腹泻患儿及社区健康儿童中人腺病毒(human adenovirus, HAdV)的流行和基因变异特征。方法:收集2015—2107年6岁以下门诊腹泻患儿以及2016—2017社区健康儿童的粪便标本共1 834份,检测HAdV六邻体基因进行分型并扩增HAdV-41纤维蛋白基因进行序列分析。结果:健康儿童和...     

北京地区人群中人Boca病毒血清抗体的分析

目的 通过对血清中人Boca病毒(HBoV)主要衣壳蛋白VP2特异性IgG抗体进行检测,初步了解北京地区人群中这种新发现的病毒的感染状况.方法 以大肠杆菌表达的HBoV主要衣壳蛋白VP2为抗原,应用Western-blot方法,对1996年4月至1997年3月取自首都儿科研究所附属儿童医院健康查体者及北京宣武医院非呼吸道感染患者的血清标本共677份进行HBoV VP2蛋白特异性IgG抗体检测.设抗组氨酸抗体及兔抗HBoV-VP2多肽特异性免疫血清为阳性血清对照.结果 (1)677份血清标本中,抗HBoV VP2蛋白的IgG抗体阳性400份,总检出率为59.1%.(2)被检对象中,＜1个月的婴儿抗体阳性率为45.3%,1个月～的婴儿抗体阳性率为41.4%,2个月～的婴儿抗体阳性率最低(31.3%),6个月～至7岁龄抗体阳性检出率在45.6%～69.7%,7岁后直至40岁,抗体阳性检出率维持在70%左右;50岁后则为61.8%～62.8%.结论 早在1996年北京地区的人群中就有59.1%曾经感染过HBoV,说明这种病毒是一种新发现的病毒而不是新出现的病毒,北京地区人群中该病毒的感染较常见.6个月龄以前的婴儿为易感人群.     

北京地区2007-2008年G9型A组人轮状病毒VP7和VP4基因分析

目的 了解北京地区2007-2008年检测到的G9型A组人轮状病毒外壳蛋白VP7和VP4的基因特征.方法 选取经过轮状病毒核酸杂交方法检测为G9型轮状病毒的12份儿童腹泻患儿的粪便标本,应用针对VP7全长基因的特异引物对进行RT-PCR扩增,对所获得的VP7全长基因进行克隆和测序,将所获得的序列与GenBank中的G9型原型病毒株和近期流行株的VP7基因进行序列和种系进化分析;经巢式PCR对G9型的VP4进行P基因分型.结果 12株G9型轮状病毒经VP7基因的序列比较分析得到确认.P基因分型结果显示北京地区近年来存在G9P[8]和G9P[6]型两种组合的轮状病毒感染.序列和种系进化分析发现北京G9型株VP7基因与世界范围内近期流行的G9型株一样都属于进化分支Ⅲ,彼此间的核苷酸和氨基酸同源性较高,而与国内最早报道的G9型T203进化关系较远,且北京G9P[8]和G9P[6]型株分别与国内近期报道的新疆G9P[8]和G9P[6]型株及相应的武汉G9型株VP7基因,在氨基酸位点上存在一些共同的氨基酸残基取代.结论 北京地区近年存在G9P[8]和G9P[6]两种不同基因组合的G9型轮状病毒感染,需要进一步加强对G9型轮状病毒的分子流行病学监测.     

改进探针标记法斑点杂交在轮状病毒VP7分型中的应用

目的建立一种更加简便的A组人轮状病毒（HRV）核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查。方法在HRV VP7编码基因各G基因型间高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV 5种常见型别（G1～4,G9型）的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT-PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析。结果建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10 pg。200份PAGE阳性标本中162份RT-RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例(25.3%),G2型2例(1.2%),G3型63例(38.9 %),G9型35例(21.6%),混合感染19例（11.7%）,杂交未分出型2例(1.2%),未检测到G4型HRV。结论本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用。通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染。     

北京市6岁以下门诊和住院腹泻患儿腺病毒检出率及流行特征

目的 了解北京单中心门诊和住院腹泻患儿腺病毒（Ad）检出情况及流行特征。方法 收集2010年1月至2013年12月首都儿科研究所6岁以下门诊腹泻、因腹泻住院和在住院期间出现腹泻症状患儿的粪便标本,采用PCR法检测Ad基因组DNA,分析流行特征。结果 进入本文分析腹泻患儿3 357例,门诊和住院腹泻患儿分别为862和2 495例。①3 357例腹泻患儿粪便标本中Ad检测阳性341例（10.2%）,门诊和住院腹泻患儿Ad检出率分别为8.1%（70/862）和10.9%（271/2 495）;门诊腹泻患儿肠道Ad（EAd）40例,包括Ad41和40型别,非肠道Ad（NEAd）30例（42.9%）,包括Ad31和Ad2等5种型别; 住院腹泻患儿EAd 271例,包括Ad41和Ad40型别,NEAd 157例（57.9%）,包括Ad31和Ad7等11种型别;门诊和住院腹泻患儿Ad和NEAd检出率差异均有统计学意义（P分别为0.022和0.002）。②Ad在门诊腹泻男女患儿中的检出率分别为9.0%和6.5%,在住院腹泻男女患儿中的检出率分别为11.7%和9.5%,差异均无统计学意义(P分别为0.206和0.086)。男女患儿Ad检出率在住院和门诊腹泻患儿间差异均无统计学意义(P分别为0.080和0.112)。③门诊腹泻患儿~6月龄、~1岁、~2岁和~6岁的Ad检出率分别为4.4%、7.7%、11.6%和12.3%,各年龄段Ad检出率差异有统计学意义（P=0.017）。住院腹泻患儿<28 d、~6月龄、~1岁、~2岁和~6岁的Ad检出率分别为4.4%、9.4%、13.2%、12.3%和13.4%,各年龄段Ad检出率差异有统计学意义(P=0.001）。④无论是门诊亦或住院腹泻患儿,全年各月均可见Ad检出。⑤Ad合并轮状病毒感染门诊腹泻患儿8/70例(11.4%),住院腹泻患儿29/271例(10.7%),差异无统计学意义（P=0.862）。结论 北京单中心门诊和住院腹泻患儿中Ad检出率为10.2%,以EAd41型占优势,NEAd31型在儿童腹泻中的作用也不容忽视。     

北京地区2007-2008年G9型轮状病毒VP4、VP6、NSP4和NSP5基因分析

本研究室在2007-2008年收集的临床标本中再次发现北京地区儿童中有G9型轮状病毒的感染,并已对其进行了VP7基因分析和VP4基因巢式PCR分型~([1,2]).为进一步了解北京G9型轮状病毒的重要蛋白基因的进化,本研究室对2例从社区感染患儿中发现的北京G9型VP4、VP6、NSP4和NSP5基因进行测序及进化分析,结果简报如下.     

儿童急性病毒性腹泻病原流行趋势分析

目的 探讨儿童急性病毒性腹泻的病原流行趋势.方法 对2013年3月至2014年12月在首都儿科研究所附属儿童医院感染科门诊就诊的急性腹泻患儿的粪便标本进行病毒学检测(包括轮状病毒、诺如病毒、肠腺病毒),新鲜粪便标本冷藏保存,使用Trizol和DNAzol试剂提取粪便标本核酸(RNA和DNA),分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测粪便标本中的轮状病毒,RT-PCR方法检测诺如病毒核酸,PCR方法检测肠腺病毒DNA.结果 留取粪便标本共1 295份,病原学阳性411份(阳性率31.7％).其中轮状病毒单一阳性282份,占阳性标本的68.6％;诺如病毒单一阳性78份,占阳性标本的19.0％;肠腺病毒单一阳性25份,占阳性标本的6.1％;2种病毒混合感染26例,占阳性标本的6.3％.不同病毒检出率呈明显季节变化,轮状病毒检出率高峰在11月份,诺如病毒检出率高峰在10月份,肠腺病毒检出率高峰在6月份,检出率分别为67.9％、18.7％、5.4％.混合感染以轮状病毒和诺如病毒感染为主.结论 轮状病毒是儿童急性病毒性腹泻的主要病原,诺如病毒成为儿童急性病毒性腹泻的第2大病原.秋冬季节为轮状病毒腹泻的高发期,诺如病毒流行季节较轮状病毒略早,肠腺病毒流行主要发生在夏季.混合感染以轮状病毒合并诺如病毒感染多见,且好发于轮状病毒流行季节.3种病毒引起的腹泻在非流行季节均有散发病例.     

北京地区人Boca病毒外壳蛋白VP2的原核表达及抗原性初步分析

目的 获得新发现的北京地区人Boca病毒(HBoV)主要外壳蛋白VP2,为对该病毒病原学的深入研究打下基础.方法 从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经PCR扩增得到HBoV VP2蛋白编码区基因片段,将其克隆至pUCm-T载体中,然后再亚克隆至原核表达载体pET-30b(+),经双酶切、PCR、序列测定等方法 挑选、鉴定阳性克隆,得到重组表达质粒pET-30b-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达;对得到的蛋白表达产物粗提物经Ni2+亲和层析纯化后,利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV-VP2多肽免疫血清及人血清进行抗原性初步分析.结果 BJ3722 VP2基因正确插入pET-30b中,开放阅读框架正确,表明得到了预期的pET-30b-VP2重组原核表达质粒.比较25℃、30℃、37℃ 3个不同温度下的蛋白表达产物,以25℃ 1 mmol/LIPTG诱导培养过夜后产生的带6×His标记的重组VP2蛋白量最大,主要以包涵体形式存在.VP2蛋白粗提物经Ni2+亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化结果.Western blot显示所表达的蛋白质能够与抗组氨酸特异性抗体、兔抗HBoV-VP2蛋白多肽免疫血清以及人血清发生反应.结论 本研究成功构建了重组pET-30b-VP2原核表达质粒,改善了表达及纯化条件,得到了较大量的HBoV-VP2蛋白表达,并初步证明表达产物具有抗原特异性,可用于对这一新发现病毒的进一步深入研究.     

改进探针标记法斑点杂交在轮状病毒VP7分型中的应用

目的建立一种更加简便的A组人轮状病毒（HRV）核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查。方法在HRVVP7编码基因各G基因型问高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV5种常见型别（G1～4,G9型）的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT—PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析。结果建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10Pg。200份PAGE阳性标本中162份RT—RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例（25．3％）,G2型2例（1．2％）,G3型63例（38．9％）,G9型35例（21．6％）,混合感染19例（11．7％）,杂交未分出型2例（1．2％）,未检测到G4型HRV。结论本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用。通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染。