TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

浙江省肾综合征出血热(HFRS)-Ⅰ型鼠脑纯化疫苗安全性、血清学、防病效果和免疫策略研究

目的　现场观察、考核兰州生物制品研究所生产的HFRS -Ⅰ型鼠脑纯化疫苗的安全性、血清免疫学与防病效果 ,并确定其免疫程序和免疫策略。方法　试验组和对照组按随机整群分组法进行分组 ;采用 0、7、2 8d及免后 1年加强 1针的免疫程序 ;分别采集免前、全程接种后 2周、加强前、加强后两周、加强后 1、2、3、4、5年的部分接种者全血和微量耳垂血 ,分别测定其中和抗体和IFA抗体 ,观察疫苗的血清免疫学效果和现场流行病学防病效果。结果　在 1995年 8月～ 2 0 0 1年 12月的 6年时间里从疫苗开始接种到加强后 5年 ,观察了HFRS -Ⅰ型鼠脑灭活纯化疫苗的安全性、血清免疫学效果和流行病学防病效果等。纵观结果 :证明该疫苗除了因疫苗中残留蔗糖导致较重较普遍的局部反应外 ,未发现其他严重的副反应 ,证明疫苗有较好安全性。从血清免疫效果看 ,86例全程接种后两周的免疫者血清 ,IFA抗体阳转率达 10 0 % ,中和抗体阳转率为4 4 4 4 % (8/ 18)。 1年后 ,IFA抗体和中和抗体阳性率分别下降到 2 8 5 7%和 14 80 %。但加强后 2周的血清IFA抗体和中和抗体阳性率分别反弹至 83 33%和 5 5 5 6 % ,其抗体几何平均滴度也随之回升 ,但不十分明显。此外 ,在加强后 2年IFA和中和抗体阳性率再次下降到较低水平 ,分别为     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

辽宁省首次从病人血清中分离出肾综合征出血热病毒及鉴定

目的：从临床确诊的肾综合征出血热（HFRS）患者血清中分离出汉坦病毒（HV）,并对分离到的病毒进行分型鉴定,填补了辽宁省从人体血液中分离HFRS病毒的空白。方法：采集发病在一周内临床确诊为EHF患者的血液（急性期血）直接用VERO-E6细胞分离病毒,并用间接免疫荧光（IFAT）及RT-PCR方法对分离到的毒株进行确定和分型鉴定。结果：从2005年至2006年度全省共收集符合做病毒分离的急性期血液样本40份,其中随机选择20份样本先接种长爪沙鼠,另外20份采用VERO-E6细胞直接分离。从接种动物肺脏中未分离出病毒,直接细胞分离分出病毒株1株。结论：对于急性期病人血分离肾综合征出血热病毒采用细胞分离比动物分离的方法似乎更安全、更经济且有利于提高分离率。     

肾综合征出血热病毒高效价免疫血清抗体毒株的筛选

肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的急性传染病。在HFRS病毒和疫苗的研究工作中，常采用间接免疫荧光抗体（IFA）技术和直接荧光抗体（FA）技术。利用高效价兔抗HFRS病毒免疫血清制备的荧光血清在检测HFRS病毒抗原：亡作中，具有特异、快速的优点忙，而荧光血清的质量与免疫血清的效价有直接关系，不同生物学特性的HFRS毒株免疫敏感动物家兔后，其免疫血清的效价有一定的差异。因此，能产生高效价免疫血清的毒株筛选是制备高质量荧光血清的关键。     

1995至1996年浙江省肾综合征出血热监测分析

１９９５至１９９６年浙江省肾综合征出血热监测分析赵芝雅龚震宇翁景清傅桂明姜理平为了掌握全省肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）流行规律，控制本病暴发流行，根据《浙江省肾综合征出血热预防和控制计划》和《浙江省肾综合征出血热监测计划》，开展了监测工作。现将１９９５...     

浙江省肾综合征出血热鼠间疫情调查

肾综合征出血热(简称HFRS)是一种多宿主自然疫源性疾病,主要传染源为鼠类.为全面了解我省HFRS宿主动物鼠间疫情特点,更好地控制传染源,加强HFRS防制,现将1994～1996年全省HFRS宿主动物资料进行整理、分析,报告如下:1 材料和方法1.1 鼠类来源 统一用江西贵溪捕鼠器械厂生产的中号铁板夹,用夹夜法定期在室内外捕鼠,调查鼠种构成和计算鼠密度.解剖取鼠肺和用滤纸擦鼠血,置低温冰箱冷冻保存待检.     

肾综合征出血热I型灭活疫苗安全性研究

肾综合征出血热（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｗｉｔｈｒｅｎａｌｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＨＦＲＳ）灭活疫苗已研制成功，推广应用后防病效果良好。为了进一步考核其在高发疫区人群接种时的安全性，我省于１９９３～１９９７年开展了有关研究，现报告如下。１材料与方法...     

ANIMAL MODEL OF RABBITS FOR RESEARCHING EPIDEMIC HEMORRHAGIC FEVER

This study reveals that the rabbit is susceptible to all epidemic hemorrhagic fever virus strains isolated from both wild rodents and humans with epidemic hemorrhagic fever. Specific fluorescence for epi- demic hemorrhagic fever virus antigen was detected in many kinds of rabbit tissue, especially in the spleen, small intestine and pancreas on the 7th-13th day of experimental infection. Using fluorescence antibody positive lungs of wild rodents, epidemic hemorrhagic fever virus can easily be isolated in rabbits as well as Apodemus agrarius. Viremia was detected in rabbits on the 4th6th day after inoculation of epidemic hemorrhagic fever virus. Epidemic he- morrhagic fever virus strains can be serially passaged in rabbits. Therefore, the rabbit provides a new animal model for the isolation and propagation of epidemic hemorrhagic fever virus and for testing the safety of epidemic hemorrhagic fever vaccine.