逆转录病毒载体介导的HBsAg抗原表达及其稳定性研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的HBsAg抗原的表达及其稳定性。方法 将HBsAg基因插入逆转录病毒载体PLXSN中，构建成重组逆转录病毒载体。用电穿孔法转染PA317细胞，包装成假病毒颗粒，在不同温度下冻存。于不同时间用假病毒颗粒感染HepG2、NIH3T3及293细胞，用RT—PCR及ELISA法检测HBsAg表达；以感染后G418抗性克隆形成数确定假病毒颗粒的活力。结果 在各个时间段HBsAg表达量均差异无显著性。在-20℃冻存时，6个月后克隆数即下降过半，12个月后仅形成少数克隆，24个月后无克隆形成；在-40℃冻存时12个月后HepG2、NIH3T3、293形成的克隆数分别为121、332和89，24个月后分别为42、137和43，与冻存前比较差异有显著性；-70℃冻存时，24个月后克隆数分别为159、463和112，与冻存前比较差异无显著性。结论 HBsAg重组逆转录病毒颗粒在-70℃保存2年后，病毒活力未受明显影响，HBsAg表达量亦无明显改变。     

血清乙型肝炎病毒DNA水平对HBV全基因组克隆效率的影响

目的：通过比较血清HBV DNA水平对一片段PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全基因组克隆效率的影响，选择出合适的HBV全基因组克隆技术，供后续的HBV的基础和临床研究。 方法：采集了慢性乙型肝炎（CHB）患者85份血清，分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增HBV全基因组，经双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体，进行HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量PCR法检测上述85份血清的HBV DNA滴度。 结果： 本研究建立的一片段PCR法扩增成功需要的血清HBV DNA浓度高于两片段PCR法,两种方法扩增的效率比较为：一片段PCR法扩增的阳性率低于两片段PCR法（P<0.01）。一片段PCR法的保真性和灵敏度分析发现： 保真性：核苷酸的人为突变率为1.13 bp/kb；灵敏度：为102个初始模板。浓度大于103的重组质粒DNA80%可以成功扩增，浓度低于该值的扩增效率比较低。结论： 血清HBV DNA水平对两种扩增方法的阳性率有一定影响，滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBV DNA滴度大于106copies/L的样本，可选用一片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术，而对HBV DNA滴度小于106copies/L样本，则可选用两片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好方法，但还需进一步优化。     

荧光定量PCR技术在检测HCV—RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值,探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率,荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法,淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比,荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高,对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。     

一种新的乙型肝炎病毒全基因组克隆技术的建立

目的建立一种乙型肝炎病毒(HBV)全基因组扩增及克隆的新方法。方法设计含SalⅠ、NotⅠ酶切位点的引物,用一片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切后将PCR产物克隆入pBlueScript-(SK-)载体,进行HBV全基因组序列测定。结果用此方法成功获得35例HBV全基因组DNA序列。同时以重组质粒为模板进行敏感性和保真性测定,其敏感性为102个初始模板,核苷酸的人为突变率为1.6bp/kb。结论此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析,为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

终末期肝病患者肝移植围手术期肾功能指标的变化

60 min及术后30 min两组患者尿β2-MG和NAG水平均高于术前(均P<0.05).重型肝炎组术前血TBIL高于肝癌肝硬化组(P<0.05).重型肝炎组术后24 h、术后1周血Scr、BUN和TBIL均明显高于肝癌肝硬化组(均P<0.05).结论 重型肝炎患者在肝移植围手术期肾功能损伤较肝癌肝硬化组严重,肝移植围手术期应注意保护重型肝炎患者的肾功能.     

两种肠道腺病毒基因型分型标本处理方法的比较

目的 通过对两种肠道腺病毒基因型分型方法进行比较,以寻找出简便快速的肠道腺病毒基因型分型方法.方法 采集114例非腹泻人群的粪便样本,方法一：在A549细胞中进行培养,提取病变细胞的DNA进行PCR扩增,然后克隆、测序,确定病毒基因型;方法二：直接提取粪便悬液过滤上清DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型.结果 114份样本中,两种方法均有12份样本检出腺病毒,阳性率为10.5%（12/114）.序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致.这12份样本分别属于人腺病毒5型（3份）、7型（2份）、12型（3份）及48型（4份）.结论 虽然两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式.PCR扩增,而无需如方法一中所进行的3次体外病毒分离实验,节省了实验的时间及成本,因此值得推荐.     

阿德福韦酯抗病毒疗效与乙型肝炎病毒基因型的关系

应答无显著差异,提示HBV基因型可能对ADV的疗效无影响.     

新型的抗线粒体抗体M2亚型IgG和IgA抗体的检测方法在原发性胆汁性肝硬化诊断中的价值

目的: 评价以新型天然M2抗原和BPO融合蛋白M2-3E(BPO)为靶抗原的 ELISA法(抗-M2-3E ELISA)检测抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)IgG和IgA抗体在原发性胆汁化肝硬化(PBC)诊断中的敏感性、特异性。 方法: 分别用间接免疫荧光法(IFL)、以丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)为靶抗原的ELISA法(抗- PDC ELISA)、抗-M2-3E ELISA法检测107例PBC、31例自身免疫肝炎(AIH)、10例原发性硬化性胆管炎(PSC)、17例丙型病毒性肝炎(HCV)、29例乙型病毒性肝炎(HBV)患者和26例健康体检者。 结果: (1)107例PBC患者用IFL、抗-PDC ELISA和抗-M2-3E ELISA 3种方法检测AMA-M2 IgG的检出率分别为:87/107(81.3%)、78/107(72.9%)、97/107(90.6%)。特异性分别为98.1%、97.2%、98.3%。抗-M2-3E ELISA法AMA-M2 IgG的检出率(90.6%)显著高于IFL法(81.3%)和抗-PDC ELISA法(72.9%)(均P<0.01)。用抗-M2-3E ELISA法检测AMA-M2 IgA的检出率为59/107(55.1%),特异性为97.2%。而总体AMA-M2 IgG和/或IgA的检出率99/107(92.5%),特异性为95.2%。(2)IFL 和 抗-M2-3E ELISA的重叠度为85%,抗-M2-3E ELISA可以在超过一半的IFL阴性的患者中检出AMA-M2 IgG和/或IgA。 结论: 抗-M2-3E ELISA法具有比IFL和抗-PDC ELISA法更高的敏感性、特异性。但是,AMA-M2 IgG和IgA都不可以单独用于诊断PBC的标记。