AAV-hVEGF165及AAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞的实验研究

目的探讨应用hVEGF165与TGFβ1基因逆转椎间盘退变的可行性。方法用分子克隆技术，从pcDNA3（＋）-AAV-hVEGF165获得AAV-hVEGF165cDNA，并克隆至AAV包装质粒pSNAV上，构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒。经酶切及测序鉴定后，用脂质体介导pSNAV-hVEG165转染HEK293细胞和血管内皮细胞。荧光免疫组化方法检测hVEGF165蛋白，并用MTT法测定hVEGF165对血管内皮细胞增殖的影响。由本元正阳公司对pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染退变的椎间盘纤维环细胞，Western blot检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hVEGF165构建完成，荧光免疫组化显示hVEGF165蛋白表达，MTT法显示hVEGF165蛋白对血管内皮细胞增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV-hVEGF165与AAV-hVEGF165构建成功。Western blot显示hVEGF165与TGFβ1在纤维环细胞中表达，AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1双基因联合转染的纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量较hVEGF165与TGFβ1基因各自单独转染的细胞Ⅰ型胶原表达量明显增多。结论hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进退变纤维环细胞Ⅰ型胶原表达增加。     

骨质疏松症大鼠骨诱导能力改变的研究

目的　探讨骨质疏松性骨折愈合困难的原因 ,为临床治疗骨质疏松性骨折寻找可行性途径和方法。　方法　雌性SD大鼠 4 0只作为供体大鼠 ,随机分为卵巢切除组和对照组 ,每组 2 0只 ,卵巢切除组切除双侧卵巢以复制骨质疏松模型 ,对照组行假手术。 4个月后处死大鼠 ,取肢体长骨按Urist方法分别制备骨基质明胶。雌性SD大鼠 17只 ,双侧股部切开 ,左、右侧肌袋内分别植入卵巢切除大鼠及对照大鼠骨基质明胶。大鼠饲养 14d处死 ,分别取出肌袋植入物组织行组织学检查及骨碱性磷酸酶 (ALP)活性、Ca含量测定。　结果　卵巢切除组的和对照组的植入物组织ALP活性单位分别为 (7 2 2± 2 5 9)IU/ g和 (12 0 1± 6 18)IU/g ,两者差异有显著性 (P <0 0 1)。卵巢切除组的和对照组的植入物组织Ca含量分别为 (5 10± 0 84 ) μg/ g和 (5 73± 0 79) μg/ g ,两者差异有显著性 (P <0 0 5 )。　结论　雌激素缺失所致骨质疏松骨的骨诱导能力较正常骨明显降低 ,骨质疏松性骨折愈合困难与骨骼中骨诱导生长因子的缺乏有关。对于骨质疏松性骨折的治疗要改进骨折固定方法 ,外源补充或促进内源性骨诱导生长因子的表达 ,对于促进骨折愈合具有重要作用。     

腰椎间盘MRI局限性高信号区的影像学分析

目的分析腰椎间盘局限性高信号区（HIZ）的影像学特征,为临床诊断和相关研究提供参考。方法回顾分析138例伴有HIZ的腰椎MRI资料。对11例16个伴有HIZ的腰椎间盘行CT椎间盘造影（CTD）。立体定位HIZ并对照分析CTD与MR图像。结果腰椎间盘HIZ在MR矢状位图像呈点状（14.36%）,圆形（58.01%）,长椭圆形（17.13%）或逗点状（10.50%）,其中圆形最常见。轴位像为线样或梭形,与CTD显示的环状破裂一致。本组HIZ均位于腰椎纤维环外缘。73个椎间盘的HIZ与椎间盘内破裂征象同时出现,1个椎间盘HIZ位于突出物下方。51个腰椎间盘矢状位图像的2个或3个相邻层面同一位置出现HIZ。CTD Dallas Ⅲ级者疼痛诱发试验多为阴性（6/7）,IV级者多为阳性（8/9）。结论腰椎间盘HIZ代表椎间盘纤维环中与放射状破裂相连的环状裂隙,临床多见于椎间盘突出前的椎间盘内破裂。矢状位连续多层面HIZ提示裂隙较长,复制性疼痛发生几率高。     

构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体

背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变,而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因（BIRC5）,通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞,应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体,Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功,这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。     

椎间盘Ⅳ型胶原的表达

①目的了解椎间盘中Ⅳ型胶原的表达及其与椎间盘退变的关系。②方法利用亲和细胞免疫组织化学技术及苏木精一伊红组织化学染色技术，观察Ⅳ型胶原在不同年龄组及退变手术椎间盘组织冷冻切片中的表达和变化情况，结合形态学变化，判断其与椎间盘退变的关系。③结果Ⅳ型胶原仅在青少年椎间盘中表达，主要分布在髓核细胞周围，且随年龄的增加，阳性染色细胞数明显增加；退变手术组及其他年龄组无Ⅳ型胶原表达；青少年组及成年组纤维环及软骨终板结构良好，而髓核存在明显的显微裂痕。④结论Ⅳ型胶原出现并存在于青少年椎间盘，是椎间盘髓核细胞对有害刺激的早期反应，可以作为椎间盘退变的早期指标之一。     

经关节突入路治疗前方骨性压迫型胸椎退行性疾患

目的 探讨经关节突入路治疗前方骨性致压型胸椎退行性疾患的手术方法和治疗效果.方法 2003年1月至2009年12月,收治前方骨性致压型胸椎退行性疾患患者22例,男16例,女6例;年龄36～72岁,平均54.2岁;胸椎后纵韧带骨化11例,胸椎间盘突出并钙化8例,胸椎后缘骨赘2例,强直性脊柱炎并胸椎假关节形成1例.患者均存在脊髓压迫症状,日本骨科协会(Japanese Orthopaedic Association,JOA)评分2～9分,平均5.2分;均经CT和MRI扫描明确胸椎退变的性质和致压物的类型.手术以揭盖法切除相应节段的棘突和全椎板,咬除双侧关节突关节,经侧后方人路切除脊髓前方的骨性致压物,椎间植骨、双侧椎弓根钉棒系统固定.结果 患者均获得随访,随访时间8～38个月,平均17.4个月.根据北京大学第三医院修订后的Epstein标准评定,优7例,良9例,改善4例,差2例;有效率90.9%(20/22),优良率72.7%(16/22).术后JOA评分为2～11分,平均8.7分.术中发生硬膜撕裂1例,胸膜损伤1例;术后发生硬膜外血肿压迫2例.无脊柱不稳和切口感染病例.结论 经关节突入路可彻底切除胸椎退行性疾患患者椎管前方骨性致压物,有效解除脊髓压迫.     

经后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定治疗寰枢不稳或脱位疗效观察

目的 评价后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定治疗寰枢不稳或脱位的临床疗效.方法 2005年5月至2008年1月,共收治各种原因引起的寰枢椎不稳或脱位患者31例,其中男性23例,女性8例;年龄17～67岁,平均43.5岁.寰枢椎不稳或脱位原因有:齿状突陈旧性骨折17例,游离齿状突8例,齿状突骨折4例,横韧带断裂1例,类风湿关节炎1例.31例患者均有枕颈痛表现,28例有颈椎活动受限,19例有不同程度颈髓受压症状和体征.所有病例均行后路寰枢椎椎弓根螺钉复位固定.记录患者手术时间、失血量和并发症发生情况;同时对手术前后有关临床疗效指标和影像学资料进行对比评价及统计学分析.结果 31例患者平均手术时间2.5 h,平均出血量300 ml.术后均获随访,随访时间6～37个月,平均13个月.1例患者术后出现切口感染,通过调整抗菌素和切口换药2周后得到控制;1例患者术后第5天出现肺动脉栓塞(经肺动脉造影证实),经抗凝等治疗2个月后康复.术中无椎动脉损伤,术后无C_2神经分布区疼痛或麻木病例.31例患者术前存在的枕颈部疼痛均减轻.19例颈脊髓损伤症患者末次随访脊髓功能JOA评分与术前相比明显提高(P<0.01).31例末次随访动态X线片未见寰枢椎移位,无内固定物断裂或松动;CT三维重建有2例患者寰枢椎后弓间骨小梁连续性中断.总融合率达93.6%.结论 后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定具有直视下置钉、术中复位、良好的三维短节段固定等优势,是良好的寰枢椎后路固定融合技术.     

退行性变椎间盘的细胞培养

背景：目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道。 目的：采用组织块细胞培养法及酶消化细胞培养法进行成人退行性变椎间盘细胞培养的可行性。 设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验,于1998-12/1999-04在青岛大学医学院山东省创伤骨科研究所完成。 材料：5份标本来源于青岛大学附属医院骨科确诊为退行性椎间盘病变患者。 方法：①组织块法培养椎间盘细胞：将组织块剪碎至小于1 mm×1 mm×1 mm,牢固敷贴于培养瓶底壁上;第1份标本加入含青霉素100 u/mL,链霉素100 mg/L,体积分数为0.1的胎牛血清的HAMF12培养基,第18天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养。第2份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。②酶消化法培养椎间盘细胞：将组织块剪碎加入2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化髓核30 min,离心去除上清液;消化的组织加入2 g/L的胶原酶,静止消化4 h;离心直至胶原酶完全清洗干净;取离心沉淀物置于培养瓶中：第1份标本加入足量的含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L,含体积分数为0.1胎牛血清的HAMF12培养基,第10天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养;第2,3份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。 主要观察指标：细胞的传代情况,细胞的形态学、超微结构观察。 结果：①在生长及增殖过程中,体积分数为0.2胎牛血清培养细胞增殖速度明显高于体积分数为0.1胎牛血清时的速度。②髓核软骨细胞多呈星形或多角形,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,来源于纤维环的成纤维细胞呈梭形,细胞核位于梭形细胞的正中央,细胞的纤丝较长。③来源于髓核组织的细胞透射电镜下可见两类形态、结构截然不同的细胞：脊索细胞和软骨样细胞。 结论：两种方法均能获得大量的退行性变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代。     

腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应

目的比较研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor β1,hTGFβ1）与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒（pSNAV2）,分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.     

胸椎椎管狭窄症术后急性硬脊膜外血肿

目的探讨胸椎椎管狭窄症术后急性硬脊膜外血肿的成因、诊断、治疗及预防措施。方法回顾性分析2003年6月～2011年12月因胸椎椎管狭窄症给予后路全椎板减压手术的患者101例,其中术后经再次手术证实术区急性硬脊膜外血肿9例,对其临床表现与再次手术情况进行分析。结果 9例患者全部获得随访,随访时间为3～45个月,平均34个月。血肿清除前神经功能评分为0.89±0.78,血肿清除后的神经功能评分为2.33±1.22,与术前相比差异有统计学意义（t=4.91,P〈0.01）。硬膜外血肿压迫时间为（7.72±7.06）min,血肿清除后神经功能恢复率与血肿压迫时间呈负相关（r=-0.789 6,P〈0.01）。结论胸椎椎管狭窄症手术后急性硬膜外血肿应尽快手术减压,血肿清除越早,术后神经功能恢复越好。