人ARPC2基因的克隆与表达

目的 构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体，并在原核细胞中进行表达与纯化．以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达，并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果 所构建的人ARPC2的His融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36000的融合蛋白。结论 成功构建了人His-ARPC2融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

糖类微生物产物的天然识别

抗感染免疫是由天然（先天）免疫（innate immunity）和获得性（adapted immunity）免疫（适应性）共同介导的。病原微生物侵入机体后，天然免疫系统作为宿主的第一道防御线，对微生物进行识别和清除。天然免疫模式从低等生物到人类都非常保守，主要通过模式识别受体（PRR）对病原微生物表面保守、共有的基团，即病原体相关分子模式（PAMPs）进行天然识别。     

Prdx4蛋白表达改变对HeLa细胞迁移和侵袭的影响

 目的: 观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法: 采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pcDNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeLa细胞系沉默Prdx4的表达;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平的变化;应用划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果: pcDNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组HeLa细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而Prdx4 shRNA HeLa稳定干扰细胞系Prdx4表达水平明显下调(P<0.05)。Prdx4过表达组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显增强,与空白对照组及空载体转染组比较,差异显著(P<0.01)。Prdx4表达干扰组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论: 上调Prdx4蛋白表达水平可促进HeLa细胞的迁移和侵袭,在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用;下调Prdx4蛋白表达水平可以明显抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

病理生理学教学改革探讨

将最新科研成果及时充实到教学中,对于提高病理生理学的教学质量具有重要意义。通过将自身的科研成果融入到病理生理学的教学中,不但显著提高了病理生理学的教学质量,更为重要的是培养了学生的学习兴趣、科研思维和创新精神。     

PRAK不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况.方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况.结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异.结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位.     

人His-AWP1融合蛋白表达载体的构建及其在原核生物的表达

目的 获取了His-AWP1融合蛋白，为了阶段深入研究AWP1的结构。功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人ECV304内皮细胞系中克隆AWP1cDNA，并将其重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒pET-14b中，经酶切，序列鉴定，选择正确重组克隆。将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，用Ni^2 -NTAHis柱纯化和SDS-PAGE分离蛋白。结果 克隆到一个627bp的AWP1cDNA片段，重组质粒目的DNA测序正确，纯化出了一个分子量约为38kD的融合蛋白，结论 用基因工程方法在原核细胞表达并成功纯化出His-AWP融合蛋白。     

利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER-ARPC2表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染HEK293细胞,利用RT-PCR和Western blot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER-ARPC2载体导入HEK293细胞时,ARPC2基因的表达受到抑制,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

人eNOS启动子不同序列驱动的红色荧光蛋白载体的构建与表达

目的:为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法:从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-1上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定,将重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red转染NIH3T3细胞,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果:PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red的构建正确,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的95％以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞,转染后48-60h开始出现,96-144h为红色荧光蛋白(RFP)的表达高峰,RFP的荧光在144h最强,168h后红色荧光逐渐消退,21d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子p_CMVIE驱动的RFP。结论:成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,它们能在哺乳动物细胞中有效表达,静息状态下呈现弱转录活性,为研究人eNOS启动子不同区及其顺式调控元件的作用提供了实用而又方便的工具。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。