银染法和鬼笔环肽染色观察不同发育阶段小鼠骨细胞突触

目的 采用银染法和鬼笔环肽染色方法探究骨细胞突触在不同发育阶段的组织形态并探讨两种染色方法在观察小鼠骨细胞不同发育阶段形态中应用价值。方法 取出生后0 d（P0）、5 d（P5）、15 d（P15）、21 d（P21）、28 d（P28）、35 d（P35）野生型小鼠的肱骨、股骨,制备冰冻切片及石蜡切片。对P35小鼠的股骨切片进行H&E染色,作为观察骨小梁和皮质骨中骨细胞的参照。对其他时期的肱骨组织切片采用银染法染色观察骨细胞和骨小管的形态,并记录各时期小鼠肱骨骨皮质和骨小梁中骨小管的长度。选取P10、P15两个时期小鼠肱骨的冰冻切片进行鬼笔环肽 iFlour-488染色,观察骨细胞的形态,并记录骨皮质中骨细胞突触的长度。结果 通过银染法染色,在P0~P15时期的小鼠肱骨骨小梁中,我们仅能观察到骨细胞轮廓,无法观察到骨小管的形态。在P21后,通过银染法可以观察到骨小梁骨细胞及骨小管的形态,且骨细胞周围骨小管的长度随年龄逐渐变长,P21 vs P28（P<0.05）,P21 vs P35（P<0.05）,排列整齐。在P15时期的小鼠肱骨骨皮质中,通过银染法即可以观察到骨细胞及骨小管的形态,且骨细胞周围骨小管的长度随年龄逐渐变长,P15 vs P21（P<0.005）,P15 vs P28（P<0.0001）,P15 vs P35（P<0.0001）,排列整齐。采用鬼笔环肽iFlour-488染色,可以观察到P10和P15时期骨细胞的完整形态,骨细胞突触随着年龄增加逐渐变长,P10 vs P15（P<0.01）,与周围骨细胞连接。结论 小鼠骨细胞突触随骨骼发育长度逐渐加长、排列逐渐整齐。银染法可以观察成年后骨细胞及骨小管的形态,对生长发育早期的骨小管形态显像不足。鬼笔环肽染色标记细胞骨架的方法适用于生长发育各时期的骨细胞染色,可以实现在发育早期对骨细胞的形态的检测。     

适用于单细胞RNA测序的半月板细胞提取方法的优化

目的 优化半月板细胞提取的方法,缩短细胞提取时间,稳定地获取细胞数量多和细胞活率高的细胞悬液,使获得的细胞悬液悬液适用于单细胞RNA测序。方法 比较细胞悬液的细胞数量及细胞活率评价不同细胞提取方法的有效性,细胞提取方法包括传统半月板细胞提取法（短时间消化和长时间消化）和优化提取法;通过分析单细胞RNA测序数据集评价优化提取法获取的细胞悬液的稳定性;通过比较优化提取法获得的单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集,分析优化提取法的可靠性。结果 在3次重复实验中,优化提取法获得细胞数量最多的细胞悬液,细胞数量超过105,且细胞活率最高,平均达80%。通过分析单细胞RNA测序数据发现每个样本中80%以上细胞的线粒体基因含量少于20%。CD34+,MCAM+细胞以及COL1A1+胞均存在每个单细胞RNA测序数据集中。在比较基于优化提取法单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集时发现,优化提取法也能捕获COL3A1+细胞,COL1A1+细胞,MYLK+细胞,BMP2+细胞,CD93+细胞和CDK1+细胞。结论 优化细胞提取方法能稳定地获得适用于10×Genomics平台的单细胞RNA测序技术的单细胞悬液。