斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学筛选

目的 化学遗传学方法 大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体.方法 乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族.在F2代同家族内自交所产生的F3代胚胎中,用以βe1为探针,实施整体原位杂交实验,进行红系造血缺陷突变体筛选,并针对所筛选到的突变体在不同造血过程缺陷表型进行分类研究.结果 和结论 筛选得到4个βe1基因表达缺失突变体,其中2个为红系特异性造血缺陷突变体,另外2个突变体同时存在红系和淋系造血缺陷.     

迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定共表达HCT116~(MIIP-Luc)结肠癌细胞系的建立

目的建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系,为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法将MIIP基因插入慢病毒载体p LEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体p LEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体p LEX-MCS-HA-MIIP及包装载体VSVG、△8.9,共转染HEK293T细胞,包装表达MIIP的慢病毒,将其感染HCT116细胞后,采用适宜浓度的嘌呤霉素筛选,建立MIIP稳定过表达的HCT116细胞。利用表达荧光素酶报告基因的慢病毒进行二次感染,建立MIIP和荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞。利用实时荧光定量PCR检测MIIP的mRNA水平,Western blot法检测MIIP蛋白水平,小动物活体成像技术观察HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞的荧光强弱。结果成功建立了MIIP荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞,在HCT116MIIP-Luc细胞中实现了MIIP过表达,生物发光成像结果显示HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞均可产生较强的荧光。结论分别建立了可传代的MIIP过表达及荧光素酶报告基因稳定共表达的结肠癌HCT116细胞株。     

斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

目的 通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体.方法 利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(FO)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体.结果 我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼.初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍.结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法.通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径.     

一种新的斑马鱼cloche突变体亚型的基因鉴定

目的斑马鱼cloche172突变体的基因鉴定。方法采用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱变雄性野生型AB斑马鱼,实施大规模正向遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozymeC(lyC)表达缺失突变体,并对其中一个名为cloche172突变体进行大体形态学观察,基因定位克隆和遗传学互补实验。结果大规模正向遗传学筛选出4个lyc表达缺失突变体,其中一个cloche172突变体受精后3d(day post fertilization,dpf)时期大体形态改变与已知但基因不明的cloche突变体相似。遗传学互补实验观察到有1/4胚胎出现类似cloche突变体的表型。同时,cloche172突变体基因定位在13号染色体近端粒的区域,与cloche突变体基因定位区域一致。而o-dianisdine实验证实cloche172突变体有较多红细胞聚集,cloche突变体仅有少量在尾部存在。结论cloche172基因与cloche基因定位一致,cloche172突变体是一个新的点突变位点的cloche突变体。     

一种斑马鱼原始造血髓系细胞突变体的研究

摘要：目的斑马鱼原始造血髓系细胞突变体1276的表型鉴定及性状分析。方法利用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲诱变野生型AB斑马鱼雄鱼的精原细胞,突变基因组保留传代,采用中性红染液对F3代的胚胎进行细胞化学染色,筛选原始
造血髓系细胞突变体。并通过细胞化学染色及检测不同谱系血细胞标记基因在不同发育阶段的mRNA及蛋白的表达水平,对其中之一突变体1276进行表型鉴定及性状分析。结果成功筛选1296个F2家族,2140个突变基因组,发现中性红
染色信号异常突变体12个。突变体1276在原始造血阶段,中性红染色全身信号缺失,小胶质细胞标记基因apoe 表达缺失,巨噬细胞标记基因l-plastin,头部表达减少,背主动脉壁腹侧区域表达正常,粒细胞、红细胞均未见异常;在定向造血阶
段,巨噬细胞仍存在异常,但粒细胞、红细胞、淋巴细胞以及造血干细胞均未见明显异常。结论突变体1276在原始造血阶段,巨噬细胞存在功能障碍,以及不同程度发育及迁徙异常;在定向造血阶段这一性状并未得到代偿。     

生精汤联合中医定向透药疗法治疗肾精亏损型男性不育症临床研究

目的:观察生精汤联合中医定向透药疗法治疗肾精亏损型男性不育症的临床疗效。方法:选取108例肾精亏损型男性不育症患者,按随机数字表法分为治疗组和对照组各54例。治疗组采用生精汤联合中医定向透药疗法治疗,对照组仅采用生精汤治疗。比较2组精子存活率、精子密度、精子前向运动率、正常精子形态率及精子DNA碎片率(DFI),评价2组临床疗效。结果:治疗组总有效率为88.89%,高于对照组的75.93%,差异无统计学意义(P0.05)。2组精子密度治疗前后比较,差异均无统计学意义(P0.05)。治疗后,2组精子存活率、精子前向运动率、正常精子形态率及DFI均较治疗前改善(P0.05);治疗组精子存活率、精子前向运动率改善情况均优于对照组(P0.05);治疗组正常精子形态率、DFI与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:生精汤联合中医定向透药疗法治疗肾精亏损型男性不育症的临床疗效优于单独使用生精汤治疗,尤其在改善精子存活率和精子前向运动率方面优势明显。